目的：在中医辨证论治思想指导下,采用与临床特征相近的类风湿性关节炎(RA)疾病模型和经改良的RA病证结合模型,对寒痹经典名方乌头汤的抗RA药效作用进行评价研究,并探讨相关机制,为乌头汤的临床合理应用提供实验依据,也为同类中药复方的研究提供方法学参考。方法：1.RA模型的建立：1) RA单纯疾病模型：选用健康雄性SD大鼠,采用Ⅱ胶原(CⅡ)乳化剂于第0和7天尾根皮下散点注射二次诱导,建立CIA模型；2)RA病证结合模型：参考文献并经改良建立RA风寒湿证(又称CIA寒证)和风湿热证(又称CIA热证)模型。在复制CIA模型的同时,模拟类风湿性关节炎致病原因,分别施加外界风寒湿(风速6m/s,相对湿度均为60%,温度为6℃,连续15天)、风湿热(风速6m/s,相对湿度均为95%,温度为37℃,连续9天)条件刺激,造成CIA寒证和CIA热证模型。2.动物分组、给药和取材：雄性SD大鼠224只,共设21天、35天两个时间点,每个时间点114只,每组16只(每个时间点8只),随机分为14组,组别如下：正常组,胶原诱导型关节炎(CIA)组,CIA加乌头汤高、中、低治疗组, CIA寒组,CIA寒加乌头汤高、中、低治疗组,CIA热组,CIA热加乌头汤高、中、低治疗组,CIA加甲氨喋呤治疗组。乌头汤1.88,3.75,7.5g/kg三个剂量(分别相当于临床0.5倍、1倍、2倍等效剂量),甲氨喋呤0.2mg/kg一个剂量(相当于临床1倍等效剂量)。从免疫当天开始给药,乌头汤每给药6天,间歇1天,甲氨蝶呤每给药3天,间歇1天。21天和35天分别处死动物,取血备用进行血液流变学、免疫学和生化学指标检测,取关节组织固定备用用于组织病理学和影像学检测,取内脏固定备用以进行般毒性检查。3.关节炎发病率和疾病严重度及寒、热证证侯指标评价：肉眼观察大鼠关节红肿症状,参照Cheryl L方法进行临床积分,踝关节大于1分或者掌关节大于1分算发病；每只大鼠4只足,观察并记录发病足数,与总足数之比即为肢体累计率；记录每只大鼠起始发病时间；采用红外热像仪检测关节表面温度；热板测痛仪检测关节疼痛阈值；肉眼观察关节红肿程度；激光多普勒血流检测仪检测右后肢足背的微血流量；血液流变检测仪检测血液粘度；红细胞压积检测仪检测红细胞压积；采用酶联免疫吸附法(ELISA;法)检测大鼠血清抗CⅡ抗体IgG和IgM含量。4.关节组织病理学与影像学改变评价：采用HE染色法镜下观察各组动物膝、踝关节的病理变化；采用X线拍摄同一侧踝关节,观察关节间隙、骨侵蚀及骨破坏情况并采用双盲法进行计分。5.关节滑膜炎症相关指标检测：采用ELISA法检测血清中细胞因子IL-1β、IL-17、TNFa、VEGF及炎症介质PGE2的表达水平；免疫组织化学法检测关节组织中炎症介质COX-1、COX-2表达水平,同时进行图像分析。6.关节软骨侵袭破坏相关指标检测：采用番红-O染色法镜下观察炎症关节软骨成分蛋白聚糖的表达情况并进行图像分析,评价软骨破坏程度。免疫组织化学法检测炎症关节软骨中蛋白水解酶ADAMTS-4、基质金属蛋白酶MMPs-1,3及其内源性特异性抑制剂TIMPs-1,3的表达水平,同时进行图像分析。7.一般毒性评估：采用电子称称取大鼠体重；观察大鼠毛色状况并记录；称取大鼠新鲜肝脏、肾脏,计算相应脏器指数；采用生化法检测血清中BUN.CK、 Cr、GOT、GPT、LDH的含量。结果：1.CIA和CIA寒、热证模型的评价及疾病严重度评估1)从反映模型成功与否和疾病严重度指标来看,复制的CIA模型大鼠临床红肿、畸形症状表现明显,发病率87.5%,临床积分最高23分,平均首次发病时间11.99天,肢体累计率45.78%；改良造模条件复制的CIA寒证、CIA热证模型,发病率均为100%,最高临床积分分别为31和28.875,首次发病时间分别为11.25和11.125天,肢体累计率分别为51.4%和53.75%；与CIA相比,风寒湿条件刺激诱导的CIA寒证和风湿热条件刺激诱导的CIA热证模型的发病率和疾病严重度均升高。2)从反映寒热证侯评价指标看,风寒湿条件刺激能降低CIA大鼠关节表面温度、提高关节疼痛阈值和升高低剪切率下的全血粘度和血浆粘度；风湿热条件刺激能升高CIA大鼠关节表面温度、降低免疫3周后CIA大鼠的关节疼痛阈值和降低全血粘度和血浆粘度；风寒湿和风湿热条件刺激对CIA大鼠红细胞压积的影响不明显,但也分别有升高和降低的作用趋势。2.乌头汤对CIA和CIA寒、热证大鼠关节炎发病率和疾病严重度的影响1)乌头汤可以降低CIA大鼠的发病率(最高降低27.5%)、临床积分(最高降低12分)、肢体累计率(最高降低14.5%)和延长首次发病时间(最高延长0.72天),降低血清抗CⅡ胶原抗体IgG(21天降低34%,34天降低33%)和IgM(21天降低30%,34天降低33%)的水平,其中1.88g/kg剂量组疗效较好；乌头汤可以降低CIA寒证大鼠的发病率(最高降低50%)、临床积分(最高降低14分)、肢体累计率(最高降低23.4%)和延长首次发病时间(最高延长2.58天),降低血清抗CⅡ胶原抗体IgG(21天降低34%,34天降低27%)和IgM(21天降低36%,34天降低29%)的水平,,其中7.5g/kg剂量组疗效较好；乌头汤也有一定的降低CIA热证大鼠发病率(最高降低12%)、临床积分(最高降低6分)、肢体累计率(最高降低4%)的作用趋势,延长首次发病时间(最高延长0.375天)的作用也很微弱,降低血清抗CⅡ胶原抗体IgG(21天降低34%,34天降低25%)和IgM(21天降低24%,34天降低23%)的水平。2)乌头汤可以降低CIA大鼠的关节表面温度(21天降低0.77℃,34天降低1.34℃)、关节表面血流速度(21天降低12%)、低剪切率下的全血粘度(21天降低9%)和红细胞压积(21天最高降低1%),提高疼痛阈值(21天提高0.84,34天提高1.05),对血浆粘度没有明显作用,其中1.88g/kg剂量组疗效较好；乌头汤可以降低CIA寒证大鼠的关节表面温度(21天降低1.42℃,34天降低1.53)℃、关节表面血流速度(21天降低16%)、低剪切率下的全血粘度(21天降低12%)和红细胞压积(21天最高降低1.92%),提高疼痛阂值(21天提高1.33,34天提高1.39),对血浆粘度没有明显作用,其中7.5g/kg剂量组疗效较好；乌头汤对CIA热证大鼠的关节表面温度、关节表面血流速度、低剪切率下的全血粘度、血浆粘度和红细胞压积均没有明显作用,能提高疼痛阈值(21天提高0.47,34天提高0.81)。3.乌头汤对不同RA模型大鼠关节组织病理学和影像学改变的影响1)乌头汤可以降低CIA大鼠的关节炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成,降低软骨和骨破坏程度,降低关节骨侵蚀程度(降低20%)和骨破坏等级(降低19%),对骨关节间隙改善不明显,其中1.88g/kg剂量组疗效较好。2)乌头汤可以降低CIA寒证大鼠的关节炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成,降低软骨和骨破坏程度,降低关节骨侵蚀程度(降低46%)和骨破坏等级(降低34%),对骨关节间隙改善不明显,其中7.5g/kg剂量组疗效较好。3)乌头汤对CIA热证大鼠关节组织病理学和影像学的改善作用不明显。4.乌头汤对不同RA模型大鼠关节滑膜炎症的影响乌头汤可以降低CIA大鼠血清中IL-1β(21天降低22.1%,34天降低32.5%)、IL-17(21天降低35.6%,34天降低19.8%)、TNFα(21天降低20.5%,34天降低34.4%)、VEGF(21天降低33.3%,34天降低37.6%)和炎症介质PGE2(21天降低34.6%,34天降低30.02%)的含量,抑制炎症关节PGE2的诱导型合成酶COX-2(21天降低25.5%)表达水平,对COX-1基本没有影响。乌头汤降低CIA寒证大鼠血清中IL-1β(21天降低41.7%,34天降低30.6%)、IL-17(21天降低32.3%,34天降低29.1%)、TNFα(21天降低26.7%,34天降低28.8%)、VEGF(21天降低34.2%,34天降低27.2%)和炎症介质PGE2(21天降低31.2%,34天降低28.8%)的含量,抑制炎症关节PGE2的诱导型合成酶COX-2(21天降低44.1%)的表达水平。乌头汤对两种模型的作用靶点相似,其中对CIA大鼠的疗效以1.88～3.75g/kg为主,对CIA寒证大鼠的疗效以3.75～7.5g/kg为主。5.乌头汤对不同RA模型大鼠关节软骨侵袭的影响乌头汤可以提高免疫21天CIA大鼠关节软骨中蛋白聚糖的含量(提供34.97%),降低关节中ADAMTS-4(降低20.1%)和MMP-3(降低39.7%)的表达水平,同时升高TIMP-1(提高27.1%)和TIMP-3(提高48.1%)的表达水平,对MMP-1的抑制作用不明显(降低3.4%)。乌头汤可以提高免疫21天CIA寒证大鼠关节软骨中蛋白聚糖的含量(提供113%),降低免疫21天CIA大鼠关节中ADAMTS-4(降低30.15%)、MMP-1(降低40%)和MMP-3(降低48.2%)的表达水平,同时升高TIMP-1(提高28.3%)和TIMP-3(提高46.9%)的表达水平。6.乌头汤对不同RA模型大鼠一般毒性指标的影响乌头汤对CIA大鼠、CIA寒证和CIA热证大鼠的体重、毛色等一般状况基本没有影响,对大鼠肝脏、肾脏指数及病理变化亦无明显影响,对大鼠血清中BUN、CK、Cr、GOT、GPT、LDH的含量有轻微影响,但无统计学意义,提示乌头汤发挥抗RA作用的同时没有观察到明显的毒副作用。结论：本研究较成功复制了大鼠RA疾病模型(CIA),同时探索建立了大鼠CIA寒、热证模型。在中医辨证论治思想指导下,对乌头汤“对证”和“不对证”治疗RA的作用进行了比较研究,并阐述部分作用机制。相关研究结论如下：1)乌头汤对CIA和CIA寒证大鼠均具防治作用。其中,乌头汤对CIA寒证的作用更强,且呈一定的量效关系(1.88g/kg-7.5g/kg剂量范围内),反之,相同剂量对CIA热证大鼠的防治作用不明显。2)乌头汤能抑制血清中细胞因子与炎症介质的含量、炎症关节软骨中蛋白水解酶和基质金属蛋白酶表达水平,同时提高基质金属蛋白酶特异性抑制剂的表达有关,这可能是其治疗CIA和CIA寒证大鼠的作用机制之一3)乌头汤对CIA和CIA寒证大鼠的作用靶点相似,相同剂量范围内对CIA寒证软骨成分和蛋白酶的调节作用优于CIA,对CIA大鼠炎症因子的效价优于CIA寒证。4)乌头汤对CIA和CIA寒、热证大鼠发挥防治作用的同时,未观察到明显的毒副作用。本研究初步揭示了中医方证对应理论的合理性和乌头汤治疗RA的科学性,相关研究结果将为乌头汤的临床合理应用提供实验依据,也为其他同类中药复方的研究提供方法学参考。