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高致病性禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)不仅可以感染禽类,给养殖业造成巨大的经济损失,而且还可以突破种间屏障感染包括人类在内的多种哺乳动物,并造成死亡,给人类的生命健康带来了严重威胁。因此对禽流感的预防具有重要的生物安全意义。疫苗免疫是预防禽流感的主要策略,当前所应用的疫苗主要为传统的鸡胚灭活疫苗,该疫苗能够有效的保护机体产生抵抗力和控制疾病的扩散,但还存在一些的缺点,例如流感大流行时鸡胚的供应不足,针对新型高产毒株的缺乏,对鸡源蛋白引起的过敏的,因此新型禽流感疫苗的研究势在必行。禽流感病毒样颗粒(Avian Influenza Virus-like particles, AI-VLPs)具有安全性高,可大量制备与免疫原性良好等特点,使其可以用于新型禽流感疫苗研究,然而AI-VLPs的成份复杂,纯化困难也是AI-VLPs疫苗研究的障碍。另外,研究表明AI-VLPs疫苗在小鼠、雪貂等动物模型上可以诱导产生不同程度的免疫保护力,但是对于AI-VLPs在禽类上的免疫保护力鲜有报道。本研究通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,分别构建了单独含有AIV结构基因血凝素(HA)与同时含有AIV结构基因HA和基质蛋白基因(M1)的重组杆状病毒。分别扩增HA基因和M1基因,并将其插入杆状病毒表达载体pFastBacDual,构建重组转移载体质粒pFastBacDual-HA和pFastBacDual-HA-M1。将重组转移载体质粒转入大肠杆菌DH10Bac感受细胞,抽提重组杆粒(rBacmid),将rBacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBV-HA和rBV-HA-M1。SDS-PAGE, western blot以及免疫组织化学法试验结果表明：重组蛋白在杆状病毒表达系统中获得了表达,并具有反应原性；透射电子显微镜观察结果显示,共表达HA和M1可以形成VLPs,而单独表达HA不能够组装成VLPs;血凝试验结果表明表达的重组蛋白HA(rHA)和(?)(?)A-M1都能够凝集鸡红细胞,血凝效价分别为1：512和1：1024。本研究将获得的重组蛋白分别用弗氏佐剂和国产矿物油佐剂乳化制备疫苗,并免疫BALB/c小鼠和SPF鸡,以血凝抑制试验(Hemagglution-inhibition, HI)和中和试验检测血清抗体水平,用A/Chicken/Anhui/09(H5N1)对免疫小鼠进行攻毒,A/Goose/QFY/2004(H5N1)对免疫的SPF鸡进行攻毒,并对疫苗免疫效果进行评价。在BALB/c小鼠免疫试验中,二免1周后免疫效果达到最佳状态,其中VLPs疫苗诱导HI抗体水平最高,可达到1：718,其次为rHA疫苗、灭活疫苗,分别为1：285、1：201,统计学分析显示灭活疫苗、VLPs疫苗与rHA疫苗差异不显著(P>0.05),VLPs疫苗与灭活疫苗差异极显著(P<0.01),三种疫苗免疫组与对照组均差异极显著(P<0.01)；在SPF鸡的免疫试验中,二免后血凝抑制检测结果显示灭活疫苗诱导的HI抗体水平最高,可达到1：1024,其次为VLPs疫苗、rHA疫苗,分别为1：331、1：181,统计学分析显示灭活疫苗组与VLPs疫苗组、rHA疫苗组差异极显著(P<0.01),VLPs疫苗与rHA疫苗差异不显著(P>0.05),疫苗免疫组与对照组差异极显著(P<0.01)。中和效价的变化趋势与HI效价的变化趋势呈正相关,VLPs疫苗组小鼠和SPF鸡在二免1周后中和效价达到最高值,分别为1：285和1：146,说明VLPs疫苗可以诱导BALB/c小鼠和鸡产生良好的免疫应答反应,而且在小鼠上产生的抗体水平要高于鸡。BALB/c小鼠攻毒后,VLPs疫苗组、rHA疫苗组和灭活苗疫苗组体重下降不明显,而对照组体重下降23%,说明三种疫苗都可以有效的保护小鼠抵抗AIV的攻击；SPF鸡攻毒后,VLPs疫苗组、rHA疫苗组和灭活苗疫苗组均未出现死亡情况,而对照组鸡全部死亡,统计学分析显示疫苗免疫组与对照组差异极显著(P<0.01),表明VLPs疫苗、rHA疫苗与灭活疫苗组一样可以保护鸡抵抗致死性AIV的攻击。本研究构建的AI-VLPs疫苗在BALB/c小鼠和SPF鸡上能够诱导高水平的HI抗体和中和抗体,并且可以保护小鼠和鸡抵抗致致死性AIV的攻击。从以上结果可以看出AI-VLPs疫苗有望作为哺乳动物和禽类的流感疫苗进行应用。