皮肤创伤后(烧伤、外伤、有创激光治疗等)色素异常在临床中十分常见,严重影响着患者的生活和心理,也越来越多的受到社会的关注。然而,目前治疗创伤后瘢痕性色素异常的疗效并不乐观,也缺乏防止伤口愈合中这种并发症出现的有效策略,对于临床医生而言面临着巨大挑战。近年来,尽管很多学者在创伤愈合及色素细胞方面进行了广泛研究,但仍未阐明其确切机制及确定良好的治疗措施。创伤后色素异常的产生是十分复杂的过程,一般认为可能与创伤后皮肤血运变化、局部炎症刺激、理化因素导致局部代谢功能紊乱、黑素细胞功能受损或丧失等因素有关。皮肤色素产生及黑素合成受到多基因、多转录因子共同参与调控,而影响黑素生物合成的因素还包括很多,如黑素细胞周围环境的物理化学性质改变、体内的细胞因子、多种激素等等。然而,黑素合成过程中的关键调控因素是酪氨酸酶基因家族,酪氨酸酶是黑素合成中的限速酶,也可以说是调节黑素合成的开关,起着至关重要的作用,其主要通过对酪氨酸起催化作用,继而使多巴胺发生羟化反应,多巴醌发生氧化反应,进而对黑素生成进行调控。有研究证实,酪氨酸酶基因家族蛋白是黑素细胞特异性蛋白,主要受小眼畸形相关转录因子(MITF)的调节。MITF通过与酪氨酸酶家族启动子中的特殊部位结合后,一方面可指导TRY和TRP-1在黑素细胞中特异性表达,另一方面可刺激启动子的转录活性,进而对黑素细胞黑素生成进行调控。因而,MITF在黑素合成过程中发挥着关键作用。多年来,在黑素细胞生物学作用的研究中,黑素生成的信号通路在黑素细胞的研究中也一直受到广泛的关注,有研究发现,在黑素合成过程中,两条重要的信号通路发挥着非常重要作用,分别是蛋白激酶A(PKA)途径和蛋白激酶C(PKC)途径,而还有其他许多信号通路也存在并参与着黑素的合成,他们之间并不是孤立存在的,而是有着密切关联性的。在黑素细胞的研究中,已证实,MITF可通过调控c AMP增高,促使PKC-β的表达,继而使PKC与c AMP途径共同结合达到协同效应。这种信号途径之间的网络状信号交联可扩大黑素生成作用的效应。皮肤创伤修复是一个复杂而多步骤的过程,也是导致皮肤色素改变的重要诱因之一,修复过程可涉及到炎症细胞的浸润,细胞的增殖迁移等多个环节。研究表明在损伤修复过程中,Ang II几乎涉及到了创伤愈合中的每个步骤。多项研究证明Ang II在局部皮肤组织中可促进角质细胞和成纤维细胞的分裂、增殖从而加速皮肤创面愈合,也可通过增加血管通透性和炎症细胞的趋化作用,进而促进皮肤创伤愈合。Ang II可促进角质形成细胞的增殖,可通过刺激成纤维细胞而合成细胞外基质成分,可通过AT1受体促进胶原合成,还可促进内皮细胞、成纤维细胞的增殖等等,均证明Ang II在创伤愈合中的重要作用。以往研究表明,在黑素瘤细胞和痣细胞上都被证实有Ang II受体的表达。有学者发现Ang II AT1受体的抑制限制了鼠黑素瘤的生长,并已有学者研究在分离的人黑素细胞中AT1受体和AT2受体m RNA水平表达情况,结果证明在培养的原始黑素细胞中,存在Ang II AT1受体的表达,而并没有AT2受体的表达。虽然许多研究表明Ang II在损伤修复中的各种功能,但AngⅡ是否在伤口愈合过程中可调节黑色素细胞系统而影响皮肤的色素变化尚是未知的研究领域。因此我们提出了问题并探索Ang II在人类黑色素细胞中的作用。本课题将以Ang II为研究目标,从研究其对黑素细胞中黑素细胞增殖和黑素合成着手,继而对Ang II对黑素细胞中AT1受体的表达调节作用进行分析,然后从信号转导途径方面对Ang II促黑素合成作用进行深入研究。通过这一原创性研究,我们可望初步探讨Ang II对人黑素细胞黑素合成的影响,加深理解Ang II调控黑素合成的分子和细胞机制,以期为进一步了解创伤修复后色素异常的机制而寻求新的治疗靶点及途径。本课题研究内容主要包括三部分:第一部分Ang II对人黑素细胞黑素合成及迁移的影响方法:根据预实验选择100 n M、10 n M、1 n M、0.1 n M、0.01 n M浓度的Ang II分别作用于黑素细胞24小时后,用噻唑蓝比色法(MTT比色法)测定细胞的活性。通过Na OH溶解法、酪氨酸酶活性分析测定黑素含量和酪氨酸酶活性。通过细胞膜滤过迁移实验,检测Ang II对黑素细胞迁移活性的影响。结果:与空白组比较,Ang II对细胞增殖无明显影响(P>0.05)。Ang II作用于黑素细胞24小时后,与空白对照组比较,在0.1~100 n M Ang II范围内酪氨酸酶活性呈剂量依赖方式明显递增,在10~100 n M范围内对黑素合成有明显促进作用(P<0.05),而在100 n M Ang II浓度时的作用均达到最强(P<0.01)。而0.01 n M浓度的Ang II,对酪氨酸酶活性没有影响;在0.01~1 n M范围内Ang II对黑素合成无显著作用(P>0.05)。细胞迁移实验则显示100 n M Ang II较空白对照组迁移至下室的细胞数目明显增加(P<0.05)。结论:Ang II对黑素细胞增殖无明显影响,可能与本实验中孵育浓度及时间有限有关;Ang II可促进黑素细胞黑素的合成及促进黑素细胞的迁移。第二部分Ang II对人黑素细胞中AT1受体及酪氨酸酶活性和蛋白表达的调节方法:用100 n M、10 n M、1 n M、0.1 n M、0.01 n M浓度的Ang II分别作用于黑素细胞24小时后,应用半定量RT-PCR和Western blot的方法,检测不同浓度下AT1受体及酪氨酸酶m RNA转录和相应蛋白的表达。同时,根据预实验结果,选取AT 1受体拮抗剂1000 n M LOS干预黑素细胞后,检测AT1受体及酪氨酸酶的m RNA转录和相应蛋白的表达变化情况,以及对黑素细胞迁移的影响情况。结果:在0.1~100 n M浓度范围内,Ang II对人黑素细胞中AT1受体及酪氨酸酶的m RNA和蛋白水平都有不同程度的上调作用;而这些作用,均可被Ang II AT1受体拮抗剂LOS所抑制。通过细胞膜滤过迁移实验结果显示,LOS并不能抑制Ang II对黑素细胞的促迁移效应。结论:AT1受体可介导Ang II诱导黑素细胞中酪氨酸酶的增加,其可能与酪氨酸酶信号密切相关;Ang II可经AT1受体调节促进黑素合成作用,但并不经AT 1受体促进黑素细胞的迁移效应。第三部分MITF和PKC参与Ang II对人黑素细胞酪氨酸酶及黑素合成作用的调节方法:按实验设计将不同浓度的Ang II与培养的黑素细胞处理后,用RT-PCR和Western blot方法对MITF m RNA和蛋白水平进行检测。而后选择特异性的PKA抑制剂H89和特异性的PKC抑制剂Ro-32-0432处理黑素细胞1小时后,加入100 n M浓度的Ang II孵育黑素细胞24小时,对黑素合成含量进行检测。再据此结果,选取100n M的Ang II和PKC抑制剂Ro-32-0432共同作用于黑素细胞后通过RT-PCR和Western-blot方法检测酪氨酸酶m RNA和蛋白水平表达的变化。用ELESIA方法检测Ang II作用后黑素细胞中PKC活性的变化。结果:Ang II可上调黑素细胞内MITF及酪氨酸酶的m RNA和蛋白水平。当选择性抑制PKC途径时,可逆转Ang II诱导黑素合成、上调酪氨酸酶m RNA及蛋白表达的作用,而PKA途径受到抑制后,Ang II的这些作用并没有受到抑制。用ELESIA的方法检测出Ang II作用后黑素细胞中PKC活性明显增加。结论:Ang II上调酪氨酸酶的表达促进黑素合成的作用一方面可能与调节MITF的转录和表达有关,另一方面可能与激活PKC途径有关。综上所述,Ang II可促进人黑素细胞的黑素合成,而其作用可能通过AT 1受体调节酪氨酸酶活性而发挥效应,而MITF、PKC也是参与Ang II促进人黑素细胞黑素合成过程中的重要因素。值得注意的是本实验结果首次对Ang II对黑素细胞功能的影响和调控做了初步研究,表明Ang II经AT1受体调节酪氨酸酶的潜在作用,并支持在黑素细胞中Ang II、酪氨酸酶和AT1受体之间的关系,支持MITF和PKC参与Ang II对黑素细胞中黑素合成的作用。AT1受体在人黑素细胞中的功能鉴定为黑素细胞的生理作用提供了新的视角,而其调控机制及其他方面功能仍需进一步深入研究,以评估AngⅡ在皮肤色素病理生理中的作用,进而为创伤后色素沉着异常寻求新的治疗靶点提供新的线索。