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随着全球极端灾害性天气频发,冷害成为蔬菜生产上的一个严重问题,造成蔬菜品质下降以及严重减产,直接影响冬、春季蔬菜周年供应。冷害影响植物的生长和发育,包括：渗透胁迫和次级胁迫如过氧化物胁迫等,常常导致植物细胞骨架结构破坏、膜脂相变、细胞水分亏缺、体内酶的活性降低和光合速率下降。但植物对冷害胁迫的响应并非是完全被动的,为了适应抵抗冷害,植物在长期的进化过程中,形成了相应的保护机制。对模式植物拟南芥的研究表明,冷驯化是一个由众多基因协同调控,有着复杂调控网络的过程,其中少数关键性调控基因控制着大量基因的表达。不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)经过一段零度以上的冷诱导,即冷驯化过程,可以获得一定的抗寒能力,但对其机理的研究较少。采用cDNA-AFLP技术,以不结球白菜抗寒自交系043为材料,从转录组水平上分离冷诱导差异表达的相关基因,为探明不结球白菜冷驯化的分子机理提供理论依据。主要研究结果如下：1.不结球白菜冷诱导相关基因差异表达的cDNA-AFLP分析采用cDNA-AFLP技术,对不结球白菜抗寒自交系043在冷诱导(4℃)下差异表达的基因进行了分析,256对引物组合共筛选了9960个cDNA片段,获得差异片段77个。其中上调表达的基因片段为57个,下调表达的基因片段为20个。对其功能比对发现,这些TDFs分别参与了基础代谢、光合作用和能量、转运、信号转导、次生代谢、防御响应、转录、细胞骨架结构,另外还有一些假想和功能未知蛋白。同时选取TDF16#、TDF21#和TDF57#进行实时定量PCR分析,结果表明这三个TDFs受冷胁迫的诱导表达,在不结球白菜冷驯化过程中可能具有重要作用。构建了不结球白菜在冷诱导下的基因表达谱,从转录组水平上鉴定了一批冷诱导相关基因,这些新基因可用于冷驯化的分子机理研究。2.不结球白菜冷诱导相关基因BcWRKY46的克隆及功能分析WRKY转录因子能广泛地参与植物的生物与非生物胁迫反应。以cDNA-AFLP技术,从不结球白菜抗寒自交系043冷诱导(4℃)的叶片中得到的一个差异表达片段TDF21#,进一步利用RACE技术获得了该基因cDNA全序列1175bp,包含有855bp的开放阅读框,编码284个氨基酸,命名为BcWRKY46。qRT-PCR结果表明,该基因表达不仅受冷胁迫诱导,还响应其它胁迫,包括盐、干旱和ABA。过量表达BcWRKY46的转基因烟草提高了抗寒、盐、干旱和ABA胁迫的能力。结果表明,BcWRKY46在提高ABA和非生物胁迫的抗性过程中有着重要的作用。3.不结球白菜冷诱导相关基因BcMCSU的克隆及功能分析采用cDNA-AFLP技术,从不结球白菜抗寒自交系043冷诱导(4℃)的叶片中得到的一个差异表达片段TDF16#,进一步利用RACE技术获得了该基因全长序列1194bp,包含有926bp的开放阅读框,编码307个氨基酸,命名为BcMCSU。其氨基酸序列与拟南芥AtMCSU编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白结构域分析表明：所推导的氨基酸序列具有完整的结构,在其N-端和C-端分别含有一个MOSC结构域。采用Gateway技术构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生型拟南芥中,经除草剂筛选,获得了抗性转基因拟南芥。4.不结球白菜冷诱导相关基因BcVIN3的克隆及功能分析采用cDNA-AFLP技术,从不结球白菜抗寒自交系043冷诱导(4℃)的叶片中得到的一个差异表达片段TDF57#,进一步利用RACE技术获得了该基因全长序列1814bp,包含有1749bp的开放阅读框,编码582个氨基酸,命名为BcVIN3。其氨基酸序列与拟南芥AtVIN3编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白结构域分析表明：所推导的氨基酸序列具有完整的结构,包含一个PHD-finger结构域。采用Gateway技术构建植物过量表达载体,通过花粉管通道法将其转入不结球白菜‘苏州青’中,经除草剂筛选,获得了抗性转基因不结球白菜。