硫霉素生物合成基因簇的异源表达及其改造

来源 :南京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gaoyijie1983
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碳青霉烯类抗生素是一种有着重要应用的β-内酰胺类抗菌剂,特别是对于有多种药物抗药性的细菌感染有着很好得效果。它们有着很广谱的抗菌活性并且对多数临床上遇到的β-内酰胺酶有抗性。尽管已经证实一些革兰氏阴性菌可以产生碳青霉烯类抗生素,但它们主要还是由链霉菌产生。硫霉素(Thienamycin)是第一个被分离到的碳青霉烯类抗生素。它由Streptomyces cattleya NRRL 8057产生,硫霉素被报道为最有效的自然产生的抗生素,它有着超广谱得抗细菌活性,并且对β-内酰胺酶有着极强的抗性。然而,硫霉素很不稳定,但通过化学合成的它的衍生物亚胺硫霉素(imipenem)在临床使用上是一种有着重要用途的抗生素,它与脱氢酶抑制剂西司他丁钠(cilastatin sodium)以1:1等量混合,商品名为泰能(Tienam)。目前硫霉素原始产生菌产量低,组分多,异源表达未见报道,所以我们想通过异源表达的手段来提高它的产量,并有可能对其生物合成基因簇进行改造从而创制新的抗生素。 重组工程(recombination-mediated genetic engineering)是一种快速而有效的构建载体的有力的方法,也是一种能直接的操纵细菌基因组的方法。入噬菌体的redα基因,是5-3外切酶,作用于双链DNA分子而产生3突出的分子;噬茵体的redβ基因,为单链结合蛋白,其结合在DNA分子的3突出端而防止宿主菌大肠杆菌的DNA内切酶对外源DNA的降解,redβ基因同时表现重组酶活性,即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火;gam基因,其抑制宿主菌RecBCD外切酶的活性;recA基因,其可以提高重组酶的活性。 这里我们使用重组工程的方法,一步直接克隆含有整个硫霉素生物合成基因簇的DNA片段。首先设计含有硫霉素生物合成基因簇两端同源臂的引物,然后在Red/ET大肠杆菌中通过同源重组,然后就能得到含有整个基因簇的质粒。尔后我们又对质粒做了改造,也是通过重组工程的方法对质粒上基因簇的一个基因(thnF)进行了新基因(Asm10 N-methyltransferase甲基转移酶,Formiminotransferase亚胺基转移酶)替代。
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