论文部分内容阅读
子宫内膜异位症（内异症，EMT）是一种妇科常见病，主要临床表现为痛经和不孕。内异症是引起不孕的重要原因之一，内异症引起的不孕约占不孕总数的30～50％，内异症患者不孕发生率为非内异症人群的20倍。由于内异症的发病机制及与不孕症的关系尚不清楚，单纯药物或手术治疗对其生育状况的改善效果并不理想，故需进一步研究内异症引起不孕的机理，为内异症不孕寻找新的诊治靶点。辅助生育技术结果研究结果显示内异症不孕患者的胚胎着床率显著低于非内异症妇女；而对内异症动物模型的研究也表明内异症在位子宫内膜缺少子宫内膜容受性的分子标记，如整合素αvβ3。因此，有学者认为内异症患者在位子宫内膜容受性的改变可能是其导致不孕的重要原因之一。Galectin-3（Gal-3）是一种糖结合蛋白，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，参与多种生理和病理过程。近年来Gal-3在细胞黏附、分化、迁移和增殖方面的作用使其在生殖领域的作用逐渐被人们重视。然而，Gal-3是否参与调节内异症子宫内膜容受性的改变国内外尚未见报道。为进一步明确子宫内膜容受性的变化与内异症患者不孕之间的关系，本研究深入系统地研究了子宫内膜容受性相关基因Gal-3在内异症患者在位子宫内膜中的表达变化及其调控机理。通过研究Gal-3在内异症患者在位内膜中的表达变化、卵巢甾体激素对该基因表达的调节以及该基因表达与生育调节重要信号通路之间的关系，来明确Gal-3与内异症性不孕症的关系，进一步探索内异症患者在位子宫内膜容受性的改变与内异症患者不孕之间的关系，为内异症不孕的病因研究和新的诊治靶点研究提供重要线索。第一部分内异症患者在位内膜Galectin-3的表达变化目的探讨Gal-3在内异症患者在位子宫内膜中的表达及意义。材料与方法收集增生晚期和分泌期的EMT患者和正常对照的人子宫内膜标本，分别采用实时定量反转录-聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）、免疫组化和Western blot检测内异症患者在位内膜及正常对照中Gal-3 mRNA及蛋白水平的表达变化，比较其表达差异。结果EMT患者在位内膜及对照组子宫内膜中均可检测到Gal-3 mRNA的表达。正常内膜和EMT在位内膜组织分泌期Gal-3的mRNA表达均高于增生期（P＜0.001）。与增生晚期和分泌中期正常子宫内膜相比，在位内膜Gal-3 mRNA表达显著下降（P＜0.001）。Gal-3蛋白定位于子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞和间质细胞。EMT患者在位内膜Gal-3蛋白表达低于正常对照组，其表达在分泌期高于增生期。结论内异症患者在位子宫内膜Gal-3 mRNA和蛋白表达降低，可能影响子宫内膜容受性从而导致不孕。第二部EMT在位子宫内膜细胞表达Galectin-3的体外研究目的探讨Gal-3在体外培养的EMT患者在位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中的表达及意义。材料与方法收集人子宫内膜，用胶原酶消化法分离培养子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞。用免疫细胞化学法进行细胞纯度鉴定。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测EMT患者在位内膜及正常对照中Gal-3 mRNA及蛋白水平的表达变化，比较其表达差异。结果分离的上皮细胞和间质细胞纯度达90％以上。无论是正常对照组还是EMT组，子宫内膜腺上皮细胞Gal-3 mRNA表达均比间质细胞高（P＜0.01）。子宫内膜腺上皮和子宫内膜间质细胞细胞中Gal-3 mRNA表达：在对照组分泌期高于增生期，EMT患者分泌期明显低于对照（P＜0.01）。EMT分泌期与增生期患者中Gal-3 mRNA表达分别低于同期对照组（P＜0.05）。EMT组分泌期子宫内膜腺上皮细胞，Gal-3蛋白表达比对照组明显下降（P＜0.05）。对照组和EMT组子宫内膜腺上皮细胞Gal-3蛋白表达比子宫内膜间质细胞高（P＜0.05）。结论子宫内膜腺上皮和间质细胞都可以合成、分泌Gal-3。分泌期子宫内膜腺上皮细胞Gal-3 mRNA和蛋白表达比间质细胞多。EMT患者Gal-3表达降低。第三部分雌孕激素对EMT在位子宫内膜细胞表达Galectin-3的调控作用目的探讨雌、孕激素对体外培养的EMT子宫内膜腺上皮细胞中Gal-3表达的影响。材料与方法体外分离培养的EMT和正常人子宫内膜腺上皮细胞，平行设立对照组和处理组，处理组分别给予不同浓度(10-10M～10-6M)的雌激素（17β-E2）和(10-9M～10-5M)孕激素（MPA）处理24小时，观察其对Gal-3转录水平的影响。10-8M雌激素、10-7M孕激素和10-8M雌激素+10-7M孕激素联合处理，分别作用24、48、72小时后进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Gal-3转录水平的表达。结果正常人子宫内膜腺上皮细胞经10-9M（2.748±0.378）、10-8M（6.767±0.737）、10-7M（3.732±0.826）、10-6M（2.730±1.023）17β-E2处理后Gal-3表达增加，与未处理组相比差异有显著性（P＜0.05）。而10-10M（2.193±1.270）E2处理后与未处理组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。10-9M（4.560±0.566）、10-8M（6.597±0.735）、10-7M（10.609±0.335）、10-6M（3.946±0.860）、10-5M（2.263±0.966）MPA处理后Gal-3表达增加，与未处理组相比差异有显著性（P＜0.01）。正常内膜腺上皮细胞经雌、孕和雌孕联合处理不同时间后，Gal-3表达上调顺序依次为处理72h＞48h＞24h＞未处理组，与未处理组相比差异有显著性（P＜0.01）。Gal-3的表达随处理时间延长而逐渐增加，呈时间依赖性。与未处理组相比，Gal-3表达为孕激素组＞雌孕激素联合组＞雌激素组（P＜0.01）。EMT组经雌、孕和雌孕激素联合处理不同时间后，Gal-3表达上调顺序依次为处理24h＞48h＞72h＞未处理组，差异有显著性（P＜0.01）。雌孕激素联合处理组、孕激素处理组和雌激素处理组Gal-3的表达不随时间依赖性下降。雌孕激素联合组Gal-3表达高于雌激素组、孕激素组，差异有统计学意义（P＜0.01），但雌激素处理组与孕激素处理组二者之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论雌激素和孕激素能上调Gal-3的表达，在正常对照组其上调作用呈剂量依赖性。孕激素处理后Gal-3表达上调最明显，雌激素削弱孕激素对Gal-3表达的上调作用。在EMT患者子宫内膜腺上皮细胞中Gal-3表达随处理时间的延长而下降；孕激素处理组Gal-3表达低于雌孕激素联合处理组。EMT患者Gal-3表达对孕激素刺激不敏感可能与EMT患者Gal-3表达水平下降有关，这可能是导致不孕的重要机理之一。第四部分NF-κB信号转导通路对EMT在位子宫内膜细胞表达Galectin-3的调控作用目的研究发现核因子kappa B（NF-κB）信号转导通路在胚胎着床中起重要作用。本实验旨在了解Gal-3在人类子宫内膜表达以及其上游调节是否与NF-κB信号通路有关。材料与方法体外分离培养的EMT和正常人子宫内膜腺上皮细胞，给予NF-κB抑制剂MG132处理1小时后，再分别给予正常培液、10-8M雌激素、10-7M孕激素和雌孕激素联合处理24小时后Western blot检测Gal-3蛋白水平的表达。结果EMT组，与空白对照相比，MG132组Gal-3表达缺失（P＜0.01）；MG132和MPA联合处理组、MG132和17β-E2联合处理组以及MG132、17β-E2、MPA三药联合处理后Gal-3表达依次增高，差异有显著性（P＜0.01）。正常子宫内膜，与空白对照相比，MG132组Gal-3表达缺失（P＜0.01）；MG132和17β-E2联合处理组以及MG132、17β-E2、MPA三药联合处理、MG132和MPA联合处理组后Gal-3表达依次增高，差异有显著性（P＜0.01）。孕激素处理后在正常内膜腺上皮细胞Gal-3表达明显上调，在EMT患者中上调作用最弱。EMT组，与单用MG132相比，MG132和17β-E2联合处理组Gal-3表达增加，差异有显著性（P＜0.01）。与MG132和17β-E2联合处理组相比，单用17β-E2处理组Gal-3表达增加，差异有显著性（P＜0.01）。与空白对照相比，17β-E2处理组Gal-3表达上调，差异有显著性（P＜0.01）。与单用MG132相比，MG132和MPA联合处理组Gal-3表达增加，差异有显著性（P＜0.01）。与MG132和MPA联合处理组相比，单用MPA处理后Gal-3表达增加，差异有显著性（P＜0.01）。与空白对照相比，MPA处理组Gal-3表达上调，差异有显著性（P＜0.01）。结论Gal-3在子宫内膜腺上皮细胞中的表达是由NF-κB依赖性途径所介导的。Gal-3上游因子雌、孕激素通过NF-κB信号转导调通路参与调节Gal-3在子宫内膜的表达。