目前,全球约50%的人口感染幽门螺杆菌(H.pylori),我国人口感染率高于世界平均水平,为50～70%。世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为第一类致癌因子,明确其为胃癌的危险因素。因此,抗幽门螺杆菌感染的控制和治疗是我们面临的重要医疗和社会问题。随着H pylori根除治疗中抗生素的广泛应用,H.pylori的耐药问题突出。对于耐药基因的鉴定,长期以来多以药靶基因和药物代谢相关基因的分析为主,如:H.pylori对克拉霉素的耐药性与克拉霉素的作用位点23S rRNA基因(A2142G、A2143G)突变有关;H.pylori对甲硝唑耐药是由于rdxA基因的突变失活,而rdxA基因编码NADPH硝基还原酶,能使甲硝唑还原而生成具有杀菌活性的代谢产物。但这种方法不能全面发现耐药相关基因及其机制。因此新的耐药性分析的方法和药物靶点的发现,是目前急需解决的重要课题。信号标签突变技术(STM)能够高通量筛选病原微生物的毒力相关基因,自1995年由Holden及其同事建立起来,该技术已用于十多种病原微生物的致病基因的研究,它是通过用病原体全基因组随机插入的突变体在动物体内进行高通量筛选,从而对病原体的毒力基因进行鉴定的一种负向筛选方法。其理论基础是:如果在与病原体致病过程有关的毒力基因中插入转座子,产生的突变体就会由于毒力基因的插入失活而无法引起持续性感染,结果不能在宿主体内存活下来。通过突变体库感染宿主,然后对存活下来的突变体进行负筛选就可鉴定出病原体的毒力相关基因。这种高通量筛选方法不仅是筛选鉴定致病相关基因的有力手段,而且是筛选耐药基因以及各种特定功能相关基因的有效方法。双组分系统是大部份细菌赋有的精密的信号传导系统,由组氨酸蛋白激酶(HPK)和效应调节蛋白(RR)两个组分组成,其功能是感知环境变化并产生适当的细胞反应,使之更好的适应外界环境变化。研究表明,H pylori ArsRS双组分系统是H pylori能够在胃黏膜内长期定植的最重要原因之一。因此,我们认为ArsRS双组分系统可能与H pylori耐药有一定关系。在ArsRS双组分系统中,酸敏感的组氨酸激酶ArsS(H pylori0165)及其反应元件ArsR(H pylori0166)调控着H pylori的大部分耐酸性基因:ureABEFGHI、α碳酸酐酶(CA)、NiKR、NixA、hypB、hypA、HspA、Fur、aspA;动力性基因:flaABEGH;毒力基因cagA等,而这些基因是H pylori生长繁殖、致病、耐药的关键,对这些基因的调控系统——ArsRS的研究有助于我们对H pylori致病及耐药机制更进一步的认识。在本实验中,我们用带有标签的重组质粒替代转座子,通过PCR扩增ArsS、ArsR基因片段,扩增产物分别克隆于载体pID700A1中,化学法转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α;然后将重组载体经电转化法转化幽门螺杆菌标准菌株,通过重组质粒插入失活,成功构建了ArsS和ArsR突变株。我们通过在不同PH值的培养基上比较突变株与野生株的的生长情况,发现ArsS、ArsR基因缺失会对幽门螺杆菌生长活性产生影响:当PH值为7.0时,突变株克隆数与野生株克隆数无明显差异,随着PH值的逐渐降低,当PH在6.0、5.0和4.0时,ArsS、ArsR突变株克隆数随着PH值的逐渐降低而明显减少,而野生株克隆数的变化则不明显。我们还惊奇地发现,ArsS、ArsR突变株对药物的敏感性明显高于野生株,说明ArsSR双组分系统可能与Hp耐药具有一定关系。在ArsS、ArsR突变株构建方法建立的基础上,我们以四种限制性内切酶酶切方法获得了Hp DNA 300-500bp片段,克隆入pID700系列载体,经电转化Hp,以抗生素筛选得到了70个幽门螺杆菌突变菌株,成功建立了Hp STM突变株文库构建方法,为进一步大规模构建H.pylori突变体文库和鉴定H.pylori耐药相关基因奠定了基础。