慢性粒细胞性白血病(Chronic Myelocytic Leukemia, CML)源于造血干细胞的t(9;22)(q34;q11)染色体易位。易位形成的融合基因编码具有高度酪氨酸激酶活性BCR-ABL蛋白并组成性激活多条信号通路,使细胞处于非依赖生长因子的高度增殖状态。根据CML病程特点,大致可分为慢性期、加速期和急变期三期。慢性期的细胞尚具有一定分化潜能,而进入急变期后,细胞分化受阻,外周血和骨髓有大量不成熟粒细胞集聚。BCR-ABL是CML治疗的最重要靶点。靶向BCR-ABL的伊马替尼(imatinib,Gleeve)已经成为CML治疗的一线药物。但是,CML病人依然存在对imatinib耐药问题。通过深入CML细胞生物学特性的调节机制研究,研发新型酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)并发掘BCR-ABL下游信号通路的抑制分子,对CML治疗的具有重要意义。Raf-MEK-ERK(后简称ERK)信号通路是BCR-ABL最重要的下游信号通路之一。ERK通路在促进细胞增殖、存活,抑制细胞凋亡,调控细胞分化的过程中发挥极为重要的作用,已成为肿瘤治疗的新靶点。多种ERK通路小分子抑制剂进入抗肿瘤临床试验阶段,有望发展成为新型抗肿瘤药物。除了ERK小分子抑制剂外,细胞内还有多种ERK内源性抑制分子,它们在维持细胞增殖平衡中发挥着重要的调节作用。Spreds(Sprouty related with EVH1 domain)是近年发现的一类与Sprouty相关的细胞膜蛋白。研究表明,Spreds对Ras-ERK信号通路的负调控作用极为显著。目前为止,在哺乳动物已发现有Spred1、Spred2和Spred3三个成员。有限的研究提示,Spreds对胚胎AGM区(Aorta-Gonad-Mesonephros region)造血、细胞增殖、血管与淋巴管的生成具有重要调节作用,在肝癌、变应反应性疾病和I型神经纤维瘤样疾病的发病中可能有重要意义。然而,Spreds在CML病理生理学过程中的作用并不清楚。为此,我们提出如下科学问题:Spred2对CML细胞的增殖、凋亡与分化等生物学特性是否具有调控作用?其调控机理是什么?针对上述科学问题,我们进行了以下实验研究。首先,我们利用本实验室成熟的重组腺病毒制备平台,成功制备了可以高效感染造血细胞的携带Spred2的重组腺病毒。主要过程如下:(1)获得目的基因:以HepG2细胞cDNA为模板,扩增Spred2 CDS全长序列,将其克隆到pCDNA3.0表达载体,测序鉴定,并验证其在HEK293的正确表达。(2)构建载体:构建pShuttle-cmv-Spred2穿梭载体,并与本室专利产品重组腺病毒骨架质粒pAd5f11p进行同源重组,产生携带Spred2的重组腺病毒载体pAd5f11p-Spred2。(3)包装病毒:线性化pAd5f11p-Spred2载体,在HEK293细胞包装病毒,经PCR、Western blot验证,确定重组腺病毒载体携带的Spred2基因在HepG2细胞能够正确表达。(4)扩增、纯化病毒颗粒:用HEK293细胞扩增重组腺病毒Ad5f11p-Spred2(后简称Ad-Spred2),利用CsCl密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度法测定病毒OD260nm和OD280nm值,估算病毒纯度。利用TCID50法测定病毒感染滴度。结果显示,本次制备病毒颗粒纯度较好(OD260nm/OD280nm=1.252),感染滴度为=2×1010,符合后续研究需求。第二,我们根据Gene bank中Spred2序列,设计并构建了其shRNA质粒干涉载体pGPH1-GFP-Spred2。主要过程如下:(1)筛选有效干涉序列:根据Spred2序列,设计合成4对候选siRNA序列。经脂质体瞬时转染HepG2细胞,Western blot检测Spred2表达水平,筛选出最有效干涉靶点,其序列为:Sense 5’-GUAUUGGAAUGCUAUGUAATT-3’。(2)构建干涉载体:根据有效siRNA序列,合成shDNA,并亚克隆到载体pGPH1-GFP,构建Spred2的shRNA表达载体pGPH1-GFP-Spred2(后简称shRNA-Spred2)。测序鉴定正确后,再次利用阳离子脂质体转染HEK293细胞,验证其干涉效率。结果显示,shRNA-Spred2对内源性和外源性Spred2在蛋白水平的干涉效率均可达到70%以上,可用于后续研究。第三,利用过表达载体和干涉载体工具,建立相应细胞模型,从正反两方面观察Spred2对CML细胞增殖、凋亡的影响。首先,用携带Spred2的重组腺病毒Ad-Spred2和对照病毒Ad-GFP或Ad-null以100MOI(multiplicity of infection)感染K562细胞,48 h后获得高表达Spred2的K562细胞。同时,用干涉载体shRNA-Spred2转染K562细胞,获得Spred2稳定沉默的K562细胞。主要检测指标与结果如下:(1)过表达Spred2对K562细胞增殖的影响:用CCK8试剂检测过表达Spred2的K562细胞与对照细胞的增殖情况。结果显示,Spred2可以抑制K562细胞增殖。(2)Spred2对ERK、SPHK1、Mcl-1信号途径的影响:Western blot检测发现,Spred2抑制K562细胞ERK组成性活化,下调SPHK1、Mcl-1等抗凋亡分子的组成性表达和SCF激活的表达水平。这提示,Spred2可能参与调控K562细胞凋亡。(3)Spred2对CML细胞凋亡的影响:用imatinib处理Spred2过表达或沉默的K562细胞,之后将细胞用Annxin-V-FICT/PI或Annxin-V-PE/7-AAD标记,FACS检测凋亡。同时,用Western blot检测活性Caspase3与PARP,或用PE-anti active Caspase3标记细胞,FACS检测,验证凋亡检测结果。收集CML患者骨髓与外周血标本,分离纯化CD34+细胞,观察过表达Spred2对imatinib诱导的CML CD34+细胞凋亡的影响。实验结果显示,Spred2过表达诱导K562细胞Caspase3依赖的细胞凋亡,并可增强imatinib的细胞毒性作用;稳定沉默Spred2部分地保护imatinib处理的K562细胞免于凋亡。Spred2过表达诱导CML CD34+细胞凋亡,增强imatinib的细胞毒作用(。4)imatinib对CML细胞Spreds表达水平的影响。将K562细胞用0-5μM剂量imatinib处理,或用5μM imatinib处理不同时间(4 h、8 h、12 h),Western blot检测细胞Spred2表达水平。同时,对imatinib处理的CML单个核细胞的Spred2和imatinib处理K562细胞的Spred1表达水平也进行了观察。结果显示,imatinib可以上调CML细胞内源性Spred2与Spred1表达。综合分析以上结果,我们认为Spred2参与imatinib诱导的CML细胞毒性作用。第四,利用Spred2过表达与RNA干涉K562细胞模型,观察Spred2对K562细胞分化的影响。主要过程与结果包括:(1)Spred2对K562细胞向巨核细胞分化的影响:K562细胞瞬时转染干涉载体shRNA-Spred2与对照载体shRNA-NC。根据形态学观察和FACS检测细胞表面CD41a分子的表达情况,发现瞬时干涉Spred2可诱导K562细胞向巨核细胞分化(。2)Spred2对PMA诱导的K562细胞向巨核细胞分化的影响:稳定干涉Spred2的K562细胞与对照细胞用PMA诱导后,观察细胞形态变化,FACS检测细胞表面分子CD41a和GPA(Glycophorin A)表达。Realtime-PCR检测巨核细胞相关转录因子GATA-2与Egr-1 mRNA水平。发现稳定干涉Spred2促进PMA诱导K562的细胞向巨核细胞分化。(3)Spred2对PMA诱导的ERK信号通路的影响:Western blot结果显示,过表达Spred2抑制PMA诱导的ERK活化,而Spred2 RNA干涉促进PMA诱导的ERK活化。(4)Spred2对K562细胞向红细胞分化的影响:建立稳定过表达Spred2的K562细胞,观察其表面标志GPA的表达。发现,Spred2可上调K562细胞GPA在mRNA和蛋白水平的表达,且促进imatinib诱导的GPA表达。此结果提示,Spred2可促进K562向红系分化。综合以上结果,我们认为,Spred2可通过对ERK信号通路的调控,对K562细胞向巨核细胞和红细胞分化发挥调节作用。综上所述,我们认为,Spred2对CML细胞的增殖、凋亡和分化均有调节作用。其作用可能是通过负调控ERK信号通路和下游SPHK1、Mcl-1等信号分子表达水平来实现。另外,Spred2分子还参与Imatinib诱导的CML细胞凋亡和向红系分化过程。Spreds很可能同众多其它ERK信号通路内源性抑制分子一样,在CML的形成中发挥重要作用,将来也可能作为新的靶分子,应用于CML的治疗。