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研究背景神经病理性疼痛程度重、持续时间长,由于其致病因素众多,发病机制不明确,缺乏有效治疗手段,已成为世界性的医学难题。背根神经节(DRG)是初级感觉神经元胞体的聚集部位,在致病因素刺激下背根神经节神经元可发生表型改变,兴奋性增高,增加痛觉信号传入;还可通过释放谷氨酸、P物质等引起中枢神经系统敏化。因此探索背根神经节内受体、离子通道等的病理改变,对于阐明神经病理性疼痛发病机制有重要意义。离子通道是神经电活动的分子基础。钾离子通道(钾通道)是亚型最多、作用最复杂的离子通道,包括电压门控、钙激活、内向整流和双孔4大类,它们在动作电位各个阶段发挥不同作用。其中双孔钾通道在细胞内外钾离子浓度梯度驱动下渗漏钾离子,形成“背景”钾电流,负责维持静息膜电位。理论上推测,双孔钾通道表达降低可以引起静息膜电位去极化,使神经元兴奋性增加;前期研究证实,神经损伤后部分双孔钾通道(K2p1.1)表达下调,这提示双孔钾通道可能在神经病理性疼痛发病过程中发挥重要作用,然而其表达调控的具体机制尚不明确。表观遗传机制是基因组DNA序列本身不改变的情况下,发育或环境因素引起的表型特征改变。表观遗传修饰包括组蛋白修饰、DNA甲基化、非编码RNA等。DNA甲基化是发现最早的表观遗传机制,可参与多个生理或病理过程比如神经可塑性改变、肿瘤等。DNA甲基化在神经病理性疼痛发病机制中的研究仍处于起步阶段。本研究以背根神经节内双孔钾通道K2p1.1为靶点,探索K2p1.1是否参与神经病理性疼痛发病过程,验证DNA甲基化是否参与K2p1.1的表达调控,为临床治疗神经病理性疼痛提供理论基础。研究方法:1.第一部分验证双孔钾通道K2p1.1是否参与神经病理性疼痛的形成和维持。(1)建立小鼠化疗诱导和外周神经损伤致神经病理性疼痛模型,Western blot和实时定量PCR检测不同时间点的背根神经节组织内K2p1.1表达变化。(2)免疫组化检测K2p1.1表达改变以及在不同细胞之间表达定位。(3)背根神经节内给予K2p1.1小干扰RNA(siRNA)观察小鼠行为学改变;检测给予siRNA后背根神经节内K2p1.1蛋白和mRNA的表达改变;全细胞膜片钳记录小鼠微注射siRNA后的背根神经节神经元电活动改变。(4)背根神经节微注射K2p1.1 AAV-DJ病毒,观察高表达K2p1.1达对神经病理性疼痛小鼠的行为学影响;检测感染AAV-K2p1.1的神经病理性疼痛小鼠背根神经节内K2p1.1蛋白和mRNA的表达改变。2.第二部分验证DNA甲基转移酶(DNMTs)是否调控K2p1.1并参与神经病理性疼痛的形成。(1)建立化疗痛模型,Western blot和实时定量PCR检测不同时间点的背根神经节组织内DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达变化。(2)免疫荧光双标观察DNMT3a和K2p1.1在背根神经节内的细胞共定位。(3)给予小鼠化疗药物和RG108(DNA甲基转移酶抑制剂),观察左右后足的机械痛阈和热痛阈改变。(4)观察基于Advillin-Cre/LoxP系统的背根神经节神经元内DNMT3a组织特异性敲除小鼠给予化疗药物后的行为学改变,检测背根神经节内DNMT3a和K2p1.1的蛋白以及mRNA表达改变。(5)构建单纯疱疹病毒HSV-DNMT3a过表达载体,感染原代培养野生型小鼠背根神经节神经元,检测DNMT3a和K2p1.1的蛋白以及mRNA表达改变。(6)构建AAV5-Cre病毒,感染原代培养DNMT3aflox/flox小鼠背根神经节神经元,检测DNMT3a后天性敲除后,K2p1.1的蛋白以及mRNA表达改变。3.第三部分验证DNMT3a对K2p1.1基因(KCNK1)启动子区甲基化调控。(1)设计覆盖KCNK1 CpG岛全长的PCR引物8对,用染色体免疫共沉淀法(ChIP)检测小鼠紫杉醇处理后背根神经节内DNMT3a与KCNK1启动子结合程度改变。(2)用DNA甲基化免疫共沉淀法检测小鼠紫杉醇(化疗药物)处理后背根神经节内KCNK1启动子区甲基化水平改变。主要研究结果1.小鼠给予化疗药物或外周神经损伤后,与对照组相比,背根神经节内K2p1.1的蛋白和mRNA表达均显著降低。2.免疫双标染色显示,K2p1.1与神经元标志物βⅢ-tubulin共同表达,而与卫星胶质细胞标志物(谷氨酰胺合成酶,GS)没有共表达,提示K2p1.1主要表达在背根神经节神经元内。K2p1.1与不同类型神经元标志物均有共表达,其中K2p1.1阳性细胞中45.8%为NF200(中、大神经元)阳性,31.9%为CGRP阳性(多肽能小神经元),18.9%为IB4阳性(非多肽能小神经元)。3.背根神经节内微注射K2p1.1小干扰RNA(siRNA)后第3天小鼠的机械刺激缩足百分比明显显著上升,热刺激缩足潜伏期显著下降,提示敲低背根神经节内K2p1.1可诱导小鼠疼痛行为;全细胞膜片钳记录发现小鼠微注射siRNA后的背根神经节大、中、小直径神经元静息膜电位显著上升,分别增加10.6mV、8.6mV和7.9mV;同时背根神经节大、中、小直径神经元的自发动作电位分别增加24%、36%和38%。4.背根神经节微注射K2p1.1 AAV-DJ病毒,可以阻断或逆转化疗药物和外周神经损伤诱导小鼠的疼痛行为改变。5.化疗痛模型背根神经节内DNMT3a在给药后7-14天增加显著,而DNMT1和DNMT3b则没有显著改变;DNMT3a与K2p1.1在背根神经节细胞共表达。6.给予RG108可以逆转化疗药物引起的疼痛行为;而背根神经节特异性敲除DNMT3a小鼠给予化疗药物,未出现明显的疼痛行为。提示DNMT3a与参与化疗诱导神经病理性疼痛的发病过程。7.体外实验发现,过表达DNMT3a可以抑制K2p1.1的蛋白和mRNA表达,而敲除DNMT3a后,K2p1.1表达显著增加。提示DNMT3a参与K2p1.1的表达调控。8.染色体免疫共沉淀实验发现,DNMT3a与K2p1.1基因启动子有结合区域;并且给予化疗药物后,DNMT3a与K2p1.1基因启动子结合率增加3.2倍;DNA甲基化免疫共沉淀实验发现,K2p1.1基因启动子的DNMT3a结合区在给予化疗药物后,甲基化率增加3.1倍,而DNMT3a敲除后,甲基化率降至22%。结论背根神经节神经元内K2p1.1蛋白表达降低,引起神经元兴奋性增加,参与神经病理性疼痛的发生和维持;K2p1.1蛋白表达降低是由于DNMT3a表达增加,K2p1.1基因启动子区域甲基化增加,进而抑制其基因转录。