【摘 要】
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猪的饲养和繁殖较为便捷,在生理结构、形态学和免疫学上与人有着诸多类似的特性。所以猪胚胎干细胞的获得具有重要的意义。但是在小鼠和人胚胎干细胞成功建系后的十几年里,依然没有获得真正意义上的猪胚胎干细胞系。其中重要原因之一在于没有明确最适合的体外培养环境。胚胎干细胞体外多能性及自我更新能力的维持主要依赖于多能性信号通路的调控。已知小鼠胚胎干细胞（na?ve状态）主要依赖LIF/STAT3信号通路,人胚胎
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猪的饲养和繁殖较为便捷,在生理结构、形态学和免疫学上与人有着诸多类似的特性。所以猪胚胎干细胞的获得具有重要的意义。但是在小鼠和人胚胎干细胞成功建系后的十几年里,依然没有获得真正意义上的猪胚胎干细胞系。其中重要原因之一在于没有明确最适合的体外培养环境。胚胎干细胞体外多能性及自我更新能力的维持主要依赖于多能性信号通路的调控。已知小鼠胚胎干细胞（na?ve状态）主要依赖LIF/STAT3信号通路,人胚胎干细胞（primed状态）依赖FGF/ERK和TGFβ/Activin/Nodal信号通路。而大鼠等啮齿类动物可以通过抑制FGF/ERK信号通路和WNT信号通路中的GSK3β建立na?ve胚胎干细胞系。在此过程中可以削弱细胞对LIF信号通路的依赖。由此可以发现胚胎干细胞的建立和多能性维持主要依赖这几条信号通路的调控。而猪胚胎干细胞与这些信号通路的关系可能与小鼠胚胎干细胞和人胚胎存在差异,并且它们对猪胚胎干细胞的调控作用尚不清楚。本文主要以实验室现有猪类胚胎干细胞为研究对象,参照猪早期囊胚及两种细胞系的RNA-Seq测序数据,对上述几条多能性相关信号通路的关键因子的表达分别进行比较分析,得出结论后对干细胞系中的信号通路分别进行抑制或激活,从而明确这些信号通路与猪胚胎干细胞多能性状态的关系。我们分别对LIF/JAK/STAT3,FGF/MEK/ERK,TGFβ/Activin/Nodal及WNT/β-catenin信号通路进行了比较分析最终得出以下结果:（1）RNA-Seq测序数据显示猪早期囊胚ICM中特异性表达STAT3,并且通过免疫荧光的染色证实了猪早期囊胚ICM中STAT3特异性表达并激活,然而对猪类胚胎干细胞LIF/JAK/STAT3信号通路激活的实验中发现,利用LIF或IL-6无法激活现有猪类胚胎干细胞中LIF/JAK/STAT3信号通路,同时JAK/STAT3信号通路对于现有猪类胚胎干细胞的多能性维持是非必需的。应用这两个激活剂重新建系也只能获得KO样猪类胚胎干细胞系。表明在现有体系下所获的猪类胚胎干细胞系并不依赖LIF/JAK/STAT3信号通路,并且单纯的利用JAK/STAT3的激活剂也很难使细胞重编程到na?ve干细胞的状态。（2）RNA-Seq测序数据显示猪类胚胎干细胞中FGF/MEK/ERK信号通路的表达模式基本与ICM类似。由此我们推断FGF/MEK/ERK信号通路的激活是维持猪胚胎干细胞多能性的关键因素。结果证实了在猪胚胎干细胞建系的过程中离不开b FGF的添加,但是b FGF的持续添加会导致胚胎干细胞表达着床后囊胚阶段特定表达的maker基因。（3）RNA-Seq测序数据显示猪类胚胎干细胞相对于早期囊胚特异性高表达TGF-β/Activin/Nodal信号通路相关基因,这说明了在猪胚胎干细胞建系的过程中抑制这条信号通路可能是获得na?ve状态胚胎干细胞的重要因素。我们利用TGF-β/Activin/Nodal信号通路的小分子抑制剂可以改善猪类胚胎干细胞的多能性状态。（4）RNA-Seq测序数据显示,相对于猪类胚胎干细胞,WNT信号通路靶基因TCF3在ICM中特异性表达,由此我们推断WNT信号通路的激活可能是维持猪胚胎干细胞多能性的关键因素。但是在研究中发现猪类胚胎干细胞中β-catenin蛋白在细胞质中积累,而不是入核去激活WNT/TCF信号通路,来增强细胞活性同时改善细胞多能性状态。虽然我们没用单独的通过对一条信号通路抑制或激活而获得na?ve状态的猪胚胎干细胞系,但是也进一步明确了这些多能性相关信号通路与猪胚胎干细胞的关系。维持多能性状态的信号通路应该是一个网络调控结构,而这几条信号通路在干细胞中的作用也是交互的。我们的研究发现在建系的过程中添加b FGF能促进细胞初代克隆的形成,但是又会促使primed状态干细胞的衍生,利用TGF-β/Activin/Nodal信号通路的抑制剂SB431542,可以使细胞更接近na?ve状态,但是所获的细胞系在细胞生长能力方面没有明显的改善,而对于WNT信号通路的研究恰好补偿了这一缺陷。因此我们的研究为最终获得猪na?ve胚胎干细胞的培养条件奠定了基础,同时为获得na?ve细胞系提供了新的建系思路。
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