发育调控相关基因在诱导棉花体细胞胚发生过程中的作用研究

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海岛棉(Gossypium barbadense L.)具有世界上最优质的棉纤维,有很高的经济价值。在我国,海岛棉只在新疆南疆地区种植。目前海岛棉生产存在产量不高、抗逆性差、纤维品质需要改良等问题。依赖于体细胞胚发生体系的转基因技术是一种高效、操作性强的植物转基因技术,但海岛棉体细胞胚发生体系的建立比较困难,具有高度的基因型依赖性,这限制了新疆海岛棉分子育种的进程。而发育调控因子可促进植物体细胞直接发育为再生植株,从而绕过传统组培过程,打破基因型对植物再生体系的限制。本研究中,通过在海岛棉下胚轴组织中过量表达GbBBM8-A及其他发育调控因子(IPT/DELLA/WUS)的基因组合,验证其是否可以诱导体细胞的分化促进植株的再生。此外,针对过量表达发育调控因子会引起再生植株发育畸形的现象,本研究还着眼于寻找一类发育特异性的启动子片段来驱动发育调控因子的表达。研究结果如下:(1)通过RT-PCR技术获得海岛棉BBM基因GbBBM8-A。该基因开放阅读框长为2019 bp,编码一个672个氨基酸的蛋白,包含两个AP2蛋白结构域。荧光定量PCR技术检测到GbBBM8-A基因在新海21体细胞胚发育的四个阶段中均有表达,其中,在鱼雷胚中表达量最高,显著高于体胚发育其他阶段,表明GbBBM8-A基因参与体细胞胚发生过程的调控。利用无缝克隆技术构建pCAMBIA3301-GbBBM8-A植物表达载体,并通过农杆菌介导法将GbBBM8-A及其他发育调控因子(IPT/DELLA/WUS)组合转化至海岛棉下胚轴后,将侵染材料转至不含任何植物激素的培养基中进行性状观测。结果表明,20 d后,对照组和GbBBM8-A与GbIPT基因组合侵染组、GbBBM8-A与GbDELLA基因组合侵染组一样,未观察到芽的形成,其下胚轴切面端栓质化严重,有的有少量愈伤组织出现;相比之下,GbBBM8-A侵染组、GbBBM8-A与GbWUS基因组合侵染组中的下胚轴中出现了叶芽的分化,但均呈现发育畸形性状。(2)通过半定量PCR实验初步检测到海岛棉LEC2(GbLEC2)在根、茎、叶和胚性愈伤组织中不表达,而在球形胚、鱼雷胚和子叶胚中的表达量显著性上升。通过生物信息学分析,发现在GbLEC2启动子序列-300 bp和-403 bp处分别含有控制种子特异性表达的Skn-1元件和RY repeat元件。为了进一步验证GbLEC2的启动子活性,本实验构建了 GbLEC2-1(2000 bp)、GbLEC2-2(1500 bp)、GbLEC2-3(1000 bp)、GbLEC2-4(500 bp)四个不同片段的GbLEC2启动子植物表达载体。并借助瞬时转染法将其转入不同的海岛棉组织细胞中。GUS染色分析结果显示,所有的GbLEC2启动子片段在胚性愈伤细胞、球形胚、鱼雷胚和子叶胚中均可以观察到GUS活性,而在叶片中则完全没有观测到GUS活性;在茎中,GbLEC2-1启动子和GbLEC2-2启动子片段表现出浅蓝色GUS染色;而在根组织(包括主根和侧根)中,仅有GbLEC2-1启动子片段呈现出GUS染色。(3)这些结果表明1000 bp和500 bp的GbLEC2启动子片段仅在体细胞胚胎发生时期有GUS活性,符合本实验对驱动“发育调控因子”表达的启动子要求。1000 bp和500 bp的GbLEC2启动子片段有望作为一种新型发育特异性候选启动子精准驱动发育调控因子的表达,从而在发育调控因子介导的新型海岛棉转基因技术中得以应用。
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