目的:　　乳腺癌是女性常见的癌症之一，其发病率位居所有女性癌症的首位。全世界肿瘤统计报告中，每年乳腺癌发病率在癌症诊断中占23％，死亡率在全世界肿瘤患者中占14％，每年我国乳腺癌新发数量和死亡数量占我国肿瘤患者总数的12.2％和9.6％。目前治疗乳腺癌的主要手段是手术及放化疗，但是这些方法都有不足之处，难以达到满意的效果，因此寻找有效治疗乳腺癌的方法具有一定的临床意义。　　上皮细胞粘附分子（Epithelial Cell Adhesion Molecule，EpCAM）是一种跨膜糖蛋白，分子量约为40kD，具有致癌潜在性。正常情况下，EpCAM不同程度地表达在除鳞状上皮细胞外的正常上皮细胞中。病理条件下，EpCAM在多种腺癌中高表达，包括乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和肺腺癌等。EpCAM对于干细胞特性、细胞信号转导、细胞粘附、迁移、增殖和分化方面有着重要作用，研究表明EpCAM可以促进乳腺癌细胞的生长和转移。　　蛋白质的糖基化是一种常见且重要的蛋白质翻译后加工修饰类型。它是指在糖基转移酶的作用下由聚糖分子与蛋白质的氨基酸残基共价结合形成糖苷键的过程。根据糖苷键结合位点不同，蛋白质糖基化主要可以分为两种类型:N-糖基化（糖基化位点为Asn-X-Ser/Thr，X是除脯氨酸以外的任意一种氢基酸）和O-糖基化(糖基化位点为Ser/Thr)。　　EpCAM的一级结构显示EpCAM存在三个N-糖基化位点(N74、N111、N198)。文献报道称，将这三个糖基化位点去除可使EpCAM的半衰期由21小时缩短至7小时，表明N-糖基化位点对于维持EpCAM的功能是必不可少的。前期研究中我们将EpCAMN-糖基化突变质粒瞬时转染到乳腺癌细胞（MCF-7、MDA-MB-231）中，结果发现EpCAM N-糖基化突变能够促进乳腺癌细胞（MCF-7、MDA-MB-231）的凋亡，并且通过增强乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231)对5-FU药物的敏感性进一步促进乳腺癌细胞（MCF-7、MDA-MB-231）的凋亡。此外，研究还发现在TGF-β1诱导下，EpCAM N-糖基化修饰通过MAPK和PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞EMT进行调控。以上实验结果证明了EpCAM N-糖基化修饰在乳腺癌细胞的发生发展中发挥着重要的作用，也为在乳腺癌的治疗中将EpCAM作为靶点，提供了坚实的理论基础。最近研究发现，肿瘤干细胞的一个额外标记是EpCAM，肿瘤干细胞具有高致瘤性和耐药性，许多恶性肿瘤都含有这种肿瘤干细胞，因此，这也使得EpCAM成为肿瘤治疗的一个更有意义的靶点。　　肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞中的一个小亚群，具备自我更新和多向分化的潜能。在乳腺癌细胞中，这一小群细胞被认为是乳腺癌肿瘤起始细胞或乳腺癌干细胞(BCSCs)。它们具备生成子代乳腺癌干细胞的独特属性，能够通过自我更新，和暂态扩增的细胞的方式进行无限增殖，而这些细胞具有一定数量的细胞分裂，并产生分化的乳腺癌细胞。只有乳腺癌干细胞能够形成二级（复发或转移性）肿瘤。　　乳腺癌干细胞表型由核心多能性因子表达调控，其中包括OCT4、SOX2和NANOG等。为了更好地了解转移和设计更有效的治疗方法，需要对调节乳腺癌干细胞表型的分子机制进行描述。EpCAM是特定细胞群的干细胞特性的指标之一，在乳腺癌中EpCAM的表达与肿瘤干细胞的多能性相关，乳腺癌干细胞具有增强自我更新能力和侵袭性的特点，这对于早期的转移步骤是至关重要的。课题组前期研究发现EpCAM N-糖基化修饰在乳腺癌细胞的发生发展中起着重要的作用，因此我们推测EpCAM N-糖基化修饰可能对乳腺癌细胞的干性具有调控作用。　　最近的研究表明，在缺氧条件下，对BCSCs的规范和/或维持需要低氧诱导因子(HIF)。此外，低氧诱导的EMT需要HIF-1α，这也和BCSC表型有关。高水平HIF-1α的表达，对于乳腺癌的早期诊断，复发和转移是一种预测，并且能够导致不良的人类乳腺癌的临床结果。低氧状态下的乳腺癌细胞中，HIF激活靶基因的转录，这些基因在肿瘤生长、血管生成、代谢重组、运动性、侵袭、转移和化疗耐药等方面发挥重要作用。　　上皮间质转化(EMT)是一种与具有干细胞样特征的癌细胞相关的过程。EMT是在胚胎发育的形态形成过程中起重要作用的发展过程。在癌症中，EMT作用于肿瘤向转移性表型的发展过程。EMT的关键特征是失去上皮细胞极性，失去细胞接触，以及获得间充质标记和增加细胞活力。因此，出现了像E-cadherin这样的上皮标记物的丢失以及如Vimentin、N-cadherin和平滑肌肌动蛋白间充质标志物的表达。EMT的诱导促进了肿瘤细胞的运动和侵袭，并有可能导致治疗抵抗。在恶性肿瘤中，EMT与肿瘤的进展有关，导致更多的运动和侵袭性细胞亚群，最终导致更多的转移表型。研究证明，EpCAM N-糖基化修饰在乳腺癌的发生发展过程中起着重要的作用，并且能够通过MAPK和PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞EMT进行调控。EpCAM的表达与肿瘤干细胞的多能性相关，而低氧对于维持乳腺癌干细胞表型具有重要的意义，因此我们探究了低氧微环境下，EpCAM N-糖基化修饰对乳腺癌细胞干性和EMT的调控作用，以求寻找一种更有效的治疗乳腺癌的方法。　　虽然目前在治疗早期乳腺癌方面已经取得了进展，但仍然没有有效的策略去预防或治疗转移，而转移是导致乳腺癌相关死亡的主要原因，因此我们需要寻找有效的治疗乳腺癌的方法，这对乳腺癌治疗来说具有一定的临床意义。缺氧是肿瘤微环境中的一个重要特征。低氧状态下的肿瘤具有干细胞特征和更强的侵袭性，增加了转移的风险，增强了对放疗和化疗的抵抗力。因此在本研究中，我们研究了低氧微环境下的乳腺癌细胞的干细胞特性的变化以及EMT的发生。首先，我们构建了体外乳腺癌低氧模型，并分析了低氧对乳腺癌细胞干性及EMT的调控机制的研究。同时，我们也探讨了EpCAM N-糖基化修饰对低氧状态下的乳腺癌细胞干性及EMT的调控作用。　　方法:　　1.应用CoCl2作为化学性低氧诱导剂，在体外构建乳腺癌细胞低氧模型;　　2.通过Western blot法和免疫荧光实验检测EpCAM对OCT4、SOX2和NANOG的表达的调节;　　3.通过Western blot法和免疫荧光实验检测低氧对OCT4、SOX2和NANOG的表达的调节;　　4.通过球体形成实验检测低氧对乳腺癌干细胞特性的影响;　　5.通过Western blot法和免疫荧光实验，检测低氧和EpCAM N-糖基化修饰对乳腺癌细胞EMT的调节;　　6.通过Western blot法检测EpCAM N-糖基化修饰对低氧诱导的NF-κB信号通路调节干性和EMT的影响。　　结果:　　1.CoCl2诱导体外乳腺癌低氧模型的建立;　　2.EpCAM N-糖基化修饰调控乳腺癌干细胞特性，调控乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的成球能力;　　3.低氧促进乳腺癌干细胞特性;低氧增强乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的成球能力;EpCAM N-糖基化修饰调控低氧状态下的乳腺癌干细胞特性;　　4.EpCAM N-糖基化修饰调控低氧状态下的乳腺癌细胞EMT的发生;　　5.低氧以及EpCAM N-糖基化修饰调控NF-κB的核转位;　　6.EpCAM N-糖基化修饰通过低氧诱导的NF-κB信号通路调节EMT和干性。　　结论:　　1.低氧诱导乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231干性增强，并且通过调控E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达促进EMT发生;　　2.EpCAM N-糖基化修饰通过低氧诱导的NF-κB信号通路干扰干性相关分子的表达和阻碍EMT的发生。