目的:肿瘤抑制基因p53是迄今为止发现与人类肿瘤相关性最高的一种基因，研究表明50％以上的人类肿瘤都发生了p53突变。p53主要在细胞周期控制通路如凋亡、细胞生长阻滞以及衰老中起着重要作用。近来，一些研究显示MAGE-A蛋白参与了p53的调节以及细胞凋亡应答。最近研究表明MAGE-A2可以与p53结合，并募集转录抑制子-组蛋白去乙酰化酶结合到p53DNA结合位点上，从而抑制p53的转录活性。有研究表明MAGE-A3蛋白与KAP1结合后会抑制p53转录活性。而有研究提示，MAGE-A4发挥了与该家族其他成员不同甚至是相反的生物学功能，它可以促进p53的转录活性以及其功能。　　 本课题旨在研究MAGE-A亚家族中MAGE-A11对p53转录活性及稳定性的影响，旨在了解MAGE-A11在肿瘤发生发展中的作用机制。　　 方法:　　 1.利用基因转染、RT-PCR和Western-blot实验方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231中p21WAF1mRNA和蛋白的表达情况。　　 2.利用基因转染和荧光素酶报告基因分析实验方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231中p21WAF1启动子介导的荧光素酶活性的表达情况，从而探讨MAGE-A11对p53转录活性的影响。　　 3.利用基因转染和克隆形成实验的方法来检测在不同的体外转染条件下乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的情况，进一步分析MAGE-A11对p53功能的作用。　　 4.利用半定量RT-PCR和Western-blot方法分析人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中转染不同量的MAGE-A11质粒之后，p53在转录水平和翻译水平上的表达，并进一步分析MAGE-A11对p53稳定性影响的情况。　　 5.利用基因转染、放线菌酮蛋白抑制分析和Western-blot方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231中MAGE-A11对p53稳定性的影响。　　 结果:　　 1.RT-PCR分析结果显示，单独转染p53质粒到乳腺癌MDA-MB-231细胞之后，p21WAF1mRNA表达水平与转染空载体对照组相比明显增高(p＜0.05)，此结果提示p53表达质粒转染成功，因为p53基因可以诱导下游基因p21WAF1的转录;共转染p53和MAGE-A11质粒组的p21WAF1mRNA表达水平与单转染p53质粒组相比无明显变化(p＞0.05);单独转染MAGE-A11质粒组的p21WAF1mRNA表达水平与空载体对照组相比，没有明显变化(p＞0.05)。这些结果提示MAGE-A11对p21WAF1mRNA表达没有影响。　　 Western-blot分析结果显示，单独转染p53质粒到乳腺癌MDA-MB-231细胞之后，p21WAF1蛋白表达水平与转染空载体对照组相比明显增高(p＜0.05)，此结果提示p53表达质粒转染成功，因为p53基因可以诱导下游基因p21WAF1的转录，增加p21WAF1蛋白的合成;共转染p53和MAGE-A11质粒组的p21WAF1蛋白表达水平与单转染p53质粒组相比，无明显变化(p＞0.05);单独转染MAGE-A11质粒组的p21WAF1蛋白表达水平与空载体对照组相比，没有明显变化(p＞0.05)。这些结果提示MAGE-A11对p21WAF1蛋白表达没有影响。　　 2.荧光素酶报告基因分析结果显示，只转染空载体质粒到乳腺癌MDA-MB-231细胞之后，p21WAF1启动子介导的荧光素酶活性为1.00±0.00;单独转染25ngp53质粒组的荧光素酶活性为27.72±1.03，和空载体对照组相比显著增加(p＜0.05);共转染恒定量25ngp53质粒和逐渐增加量(100ng、200ng、400ng)MAGE-A11质粒之后，各实验组的荧光素酶活性分别为48.90±4.77、60.11±2.66、51.47±4.52，与单独转染p53质粒组相比，明显增高(p＜0.05);单独转染400ngMAGE-A11质粒组的荧光素酶活性为1.86±0.71，与空载体对照组相比，没有明显变化(p＞0.05)。此结果提示外源性MAGE-A11可增强p53的转录活性，但不存在剂量依赖性。　　 3.克隆形成实验结果显示，只转染空载体、单独转染p53、共转染p53和MAGE-A11以及单独转染MAGE-A11质粒到乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞之后，各组的细胞克隆数分别是121.67±2.08、60.33±1.53、26.33±1.53、127.00±2.00，该结果显示，单独转染p53质粒组的细胞克隆数明显少于空载体对照组(p＜0.05);共转染p53和MAGE-A11质粒组的细胞克隆数明显少于单独转染p53质粒组(p＜0.05);单独转染MAGE-A11质粒组的细胞克隆数与只转染空载体质粒组相比，没有明显变化(p＞0.05)。这些结果提示MAGE-A11可增强p53的转录活性及由此引起的抑制细胞增殖的功能。　　 4.RT-PCR分析结果显示，单独转染p53质粒组与空载体对照组相比，p53mRNA表达量明显增加(p＜0.05)，结果提示p53质粒转染成功;单独转染1μgp53质粒组、共转染1μgp53和1μgMAGE-A11质粒组以及共转染1μgp53和2μgMAGE-A11质粒组，三组比较p53mRNA表达量没有明显差异(p＞0.05)。　　 Western-blot分析结果显示，单独转染1μgp53质粒后，p53蛋白表达水平与空载体对照组相比，明显增加(p＜0.05)，结果提示p53质粒转染成功;共转染1μgp53和1μgMAGE-A11质粒后，p53蛋白表达水平明显高于单独转染p53质粒组(p＜0.05);共转染1μgp53和2μgMAGE-A11质粒后，p53蛋白表达水平明显高于共转染1μgp53和1μgMAGE-A11质粒组(p＜0.05)。这些结果提示MAGE-A11在转录水平上对p53的表达没有影响,而其在翻译水平上对p53的表达有影响，并起到促进作用。　　 5.放线菌酮蛋白抑制分析结果显示，在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，转染1μgp53和1μg空载体质粒的对照组，经放线菌酮处理0、1、2、4、6h后，利用Western-blot检测的p53蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值分别为0.978±0.002、0.787±0.002、0.477±0.001、0.345±0.003、0.285±0.002;而转染1μgp53和1μgMAGE-A11质粒的实验组所得出的结果则分别为1.019±0.001、0.976±0.001、0.894±0.004、0.678±0.001、0.499±0.003。两组之间的差异具有统计学意义(p＜0.05)。此结果提示MAGE-A11可增加p53的稳定性。　　 结论:　　 1.外源性MAGE-A11可促进p53的转录活性。　　 2.MAGE-A11在翻译水平上增加p53的稳定性。