目的:本课题旨在构建针对HOXA5sh RNA真核表达载体p RNAT-GFP-Neo-HOXA5沉默HOXA5基因表达,探讨其对Jurkat细胞Livin蛋白、Smac蛋白表达的影响,为白血病的靶向治疗提供理论依据和线索。方法:1、根据HOXA5基因的m RNA序列,设计合成三条针对HOXA5基因不同位点的si RNA序列,并筛选有效干扰HOXA5基因表达的特异性si RNA序列,构建靶向HOXA5的sh RNA真核表达载体p RNAT-GFP-Neo-si HOXA5。2、实验分组:取对数期细胞(约3x107/ml),将Jurkat细胞分为三组:实验组(脂质体转染靶向HOXA5的si RNA)、阴性对照组(脂质体转染阴性对照si RNA)和空白对照组(仅加等量细胞及培养基)。3、转染后FQ-PCR:通过脂质体LipofectamineTM2000介导si RNA转染Jurkat细胞,48h后通过FQ-PCR和Western blot测定实验组、阴性对照组和空白对照组三组Jurkat细胞HOXA5m RNA和蛋白以及Livin、Smac蛋白相对表达水平。结果:1、设计并构建针对HOXA5基因的短发卡RNA(Short hairpin,sh RNA),与空白对照组和阴性对照组作比较,HOXA5基因的表达量在实验组明显下调,转染后实验组各组Jurkat细胞基因表达受抑制,抑制率分别为:p R N A T-G F P-N e o-H O X A 5 A(2 4.6 2±2.3 4)%,p RNAT-GFP-Neo-HOXA5B(35.07±3.21)%,p RNAT-GFP-Neo-HOXA5C(70.89±6.41)%,其中序列p RNAT-GFP-Neo-HOXA5C的效果最为显著。2、成功构建了有效沉默HOXA5基因的质粒表达载体;与阴性对照组(1.34±0.16)%和空白对照组(1.29±0.21)%相比,实验组(p RNAT-GFP-Neo-HOXA5C)HOXA5m RNA表达水平(0.39±0.01)%明显下降(P<0.05)。与阴性对照组(0.84±0.02)及空白对照组(0.85±0.01)相比,实验组(p RNAT-GFP-Neo-HOXA5C)Jurkat细胞HOXA5蛋白表达水平(0.18±0.01)较明显下降(P<0.05)。3、实验组livin蛋白表达量(0.20±0.02)明显低于阴性对照组(1.45±0.01)和空白对照组(1.33±0.01)(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组比较无明显差异(P>O.05);4、实验组Smac蛋白表达量(1.26±0.03)明显高于阴性对照组(0.87±0.03)和空白对照组(0.86±0.03)(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组比较无明显差异(P>O.05)。结论:1、成功构建的针对HOXA5基因的si RNA表达载体,能够有效沉默HOXA5基因的表达,下调HOXA5表达能直接诱导Livin蛋白表达下调和Smac蛋白表达上调,并促进细胞凋亡;2、本研究为急性淋巴细胞白血病靶向治疗提供了新的理论依据。