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目的：本项同拟采用全细胞膜片钳记录技术,系统观察姜黄素对急性分离的大鼠心室肌细胞钠通道(INa)、L型钙通道(ICa-L)、钾通道(包括瞬时外向钾通道Ito、内向整流钾通道Ik1)电流的影响,探讨姜黄素对心肌细胞的离子通道作用机制。
方法：采用急性酶解分离法,以改良Langendorff逆行主动脉灌流模式,分离大鼠心室肌细胞,获得成活率高,状态稳定的心室肌细胞。采用电极拉制仪拉制尖端大小适度,电阻恒定并适合封接的玻璃电极。实验前吸取少许富含细胞的细胞保护液(KB液)于灌流槽中静置,待细胞沉底附壁后,用细胞外液进行表面灌流。在倒置显微镜下,用微操纵仪将充好电极内液的玻璃电极移向细胞膜,负压吸引,形成高阻封接,打破细胞膜后形成全细胞记录模式,针对各种不同通道选用不同的刺激方式,记录INa、ICa-L、Ito和Ik1原始曲线。用加药系统灌流50μmol/L姜黄素5min,观察50μmol/L的姜黄素对IN啊、ICa-L、Ito和Ik1的影响,计算其抑制率,并研究其对各通道电流密度-电压曲线的影响。
结果：通过酶解法得到大鼠心室肌细胞能够记录到各种离子通道电流。表明其具有良好的细胞电生理特性。
以测试电压-30mV,对5个大鼠心室肌细胞的INa峰值电流密度作为观察指标,得出50μmol/L姜黄素灌流前后INa的电流密度分别为(-17.0±3.8)(pA/pF)和(4.7±1.0)(pA/pF)(P<0.01),抑制率为(72±6)％。INa的激活电压在-60 mV,峰电位在-30mV,反转电位在+20mV。50μmoI/L的姜黄素对所有指令电压条件下均引起INa的降低,使电流密度-电压曲线上移,不改变激活电位和反转电位,峰值电位稍右移。
以测试电压10 mV,对5个大鼠心室肌细胞的ICa-L峰值电流密度作观察指标,得出50μmol/L姜黄素灌流前后ICa-L的电流密度分别为(-6.4±0.8)(pA/pF)和(-6.5±1.4)(pA/pF)(P>0.05),抑制率为(-2±13)％。ICa-L的激活电压为-30 mV,峰值电位在10 mV,反转电位+35 mV。50μmol/L的姜黄素对ICa-L的电流密度-电压曲线没有明显影响。
以测试电压50mV,对5个大鼠心室肌细胞的Ito峰值电流密度作观察指标,得出50μmol/L姜黄素灌流前后Ito的电流密度分别为(7.7±3.3)(pA/pF)和(1.1±0.8)(pA/pF)(P<0.05),抑制率为(84±11)％。Ito的激活电压在-30 mV,电流随刺激电压增高而增大,并呈现出外向整流的特点。50μmol/L的姜黄素对所有指令电压条件下均引起Ito的降低,但不改变其外向整流的特点。
以测试电压-80 mV,对5个大鼠心室肌细胞的Ik1峰值电流密度作观察指标,得出50μmol/L姜黄素灌流前后Ik1的电流密度分别为(-9.6±1.1)(pA/pF)和(-4.0±1.1)(pA/pF)(P
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