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目的研究lnc-ob1促进BMSCs成骨分化的生物学效应及其分子机制方法1、体外构建小鼠BMSCs成骨向分化模型,QPCR方法检测BMSCs成骨向分化过程中lnc-ob1的表达水平。2、在小鼠BMSCs细胞中转染lnc-ob1真核表达载体以过表达lnc-ob1,转染lnc-ob1 ASO以敲低lnc-ob1,然后成骨向诱导分化;QPCR方法检测成骨分化marker基因Alp、Bglap的表达;茜素红染色观察矿化结节;碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶含量。3、采用RNA-seq方法,筛选在成骨细胞中过表达及敲低lnc-ob1后差异性表达的基因。4、GO富集差异表达的基因;KEGG对差异表达基因进行信号通路聚类。5、QPCR、Western blotting法检测信号通路关键因子和下游基因的m RNA及蛋白水平。6、RNA pull-down与质谱联用筛选lnc-ob1的结合蛋白;RNA pull-down、RIP方法验证lnc-ob1与结合蛋白的相互作用。7、QPCR方法检测lnc-ob1对结合蛋白表达水平的影响;Western blotting方法检测lnc-ob1对结合蛋白含量的影响;Ch IP实验检测基因启动子区H3K27三甲基化状态。结果1、与BMSCs成骨分化0周的样品相比,成骨分化1周时lnc-ob1含量上调约2.3倍,成骨分化2周时lnc-ob1含量上调约4.8倍,成骨分化3周时lnc-ob1含量上调约8倍。2、过表达lnc-ob1的BMSCs细胞,成骨向诱导分化两周后,成骨分化marker基因Alp、Bglap表达上调;矿化结节数目增加;碱性磷酸酶活性增强。3、敲低lnc-ob1的BMSCs细胞,成骨向诱导分化两周后,成骨细胞marker基因Alp、Bglap表达下降;矿化结节数目减少;碱性磷酸酶活性减弱。4、由RNA-seq筛选得到,在成骨细胞中过表达lnc-ob1后,共有161个基因表达发生了显著性变化,其中98个基因表达上调,63个基因表达下调;在成骨细胞中敲低lnc-ob1后,共有374个基因表达发生了显著性变化,其中228个基因表达上调,146个基因表达下调。两者取交集,差异表达的基因共70个。5、GO分析发现,差异表达基因在成骨分化等功能分类出现了富集(P<0.05)。KEGG分析发现,在成骨分化相关的基因中,Sp7信号通路的基因显著富集。6、在成骨细胞中过表达lnc-ob1后,Sp7的表达水平升高,其下游基因Bsp、Fgf3表达水平升高;敲低lnc-ob1后,Sp7的表达水平下调,其下游基因Bsp、Fgf3表达水平下调。7、RNA pull-down与质谱联用鉴定到lnc-ob1的结合蛋白为Suz12,RNA pull-down、RIP实验验证了lnc-ob1与Suz12的相互作用。8、QPCR结果表明,过表达或敲低lnc-ob1后Suz12的表达水平没有显著性变化;Western blotting结果表明,过表达或敲低lnc-ob1后Suz12蛋白含量没有显著性变化。9、Ch IP实验结果表明,在成骨细胞中过表达lnc-ob1后,Sp7启动子区的H3K27三甲基化水平下降;敲低lnc-ob1时,Sp7启动子区的H3K27三甲基化水平上升。结论1、lnc-ob1在BMSCs成骨向分化过程中表达量升高。2、体外过表达lnc-ob1能够促进BMSCs成骨向分化。3、体外敲低lnc-ob1能够抑制BMSCs成骨向分化。4、在成骨细胞中lnc-ob1主要调控成骨分化相关基因的表达。5、lnc-ob1能调控Sp7信号通路。6、lnc-ob1能够促进Sp7及其下游基因的表达。7、lnc-ob1能与Suz12结合。8、lnc-ob1不影响Suz12的表达水平和蛋白水平。9、lnc-ob1能够降低Sp7启动子区H3K27三甲基化丰度,从而促进Sp7表达。