慢病毒介导的Id1基因RNA干扰对肺癌骨转移的影响及其分子机制的研究

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目的:构建能表达人Id1基因shRNA慢病毒载体,为实现Id1基因shRNA在肿瘤细胞中长期、高效的表达奠定基础。方法:(1)通过Hpa I and XhoI双酶切pFU-GW-RNAi-GFP慢病毒载体质粒,然后将含Id1基因shRNA序列的DNA oligo退火形成双链后连接到该载体质粒上,构建重组载体质粒pFU-GW-ID1shRN A-GFP,通过DNA测序进行鉴定。(2)利用Lipofectamine2000将pFU-GW-ID1shRNA-GFP联合辅助质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞,收集并浓缩慢病毒上清得到慢病毒颗粒(Lenti-Id1shRNA)储存液,逐孔稀释法测病毒滴度。结果:(1)DNA测序分析表明,目的Id1基因shRNA序列己经插入病毒载体质粒,且与目的序列完全一致;(2)成功制备表达Id1基因shRNA的慢病毒颗粒浓缩液,滴度为2x109Tu/ml。结论:表达人Id1基因shRNA的第慢病毒载体pFU-GW-ID1shRNA-GFP构建成功。目的:探讨Id1基因在人肺癌A549细胞生长及侵袭中的作用以及对TSP-1表达的影响。方法:(1)用高滴度的表达Id1shRNA(Lenti-Id1shRNA)或阴性对照shRNA (Lenti-NCshRNA)的慢病毒液感染A549,通过倒置相差荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)来评估转染效率。(2)western blot检测A549细胞中Id1蛋白来鉴定RNA干扰效率。(3)分别通过CCK8法、PI染色法,Transwell小室法检测A549增殖活性、细胞周期,侵袭。(4)用realtime PCR检测A549细胞中Id1mRNA与TSP-1mRNA的表达。结果:A549在转染慢病毒96后,在荧光显微镜下见明亮的绿色荧光,最佳感染复数(MOI)为20,转染效率接近96%。与对照组相比,Id1RNA干扰组Idl蛋白表达水平显著性下降(p<0.05)。与对照组相比,干扰组A549细胞活力下降(p<0.001)。干扰组A549细胞与对照组相比,G1期比例升高(85.10±1.31%vs.60.49±0.12%,P<0.001);S期细胞比例显著性下降(7.32±0.99%vs.35.55±0.15%,P<0.001)。与对照组相比,干扰组A549细胞侵袭能力下降约50%,(P<0.05)。与对照组相比,干扰组TSP-1mRNA水平升高6.5倍(P<0.05)。结论:慢病毒介导的shRNA能够高效沉默Idl基因。在A549细胞中,Idl基因沉默导致了细胞增殖活性下降,细胞周期G1-S期阻滞,细胞侵袭能力降低,并促进了TSP-1表达水平的升高。目的:构建肿瘤骨转移裸鼠模型,探讨Idl基因在肿瘤骨转移中作用。方法:购买4-5周龄BALB/C雄性裸鼠43只,干扰组和对照组各20只,空白组3只。A549在转染慢病毒Lenti-Id1shRNA或Lenti-Id1shRNA4天后用PBS制备成单细胞悬液。利用26gG针头向干扰组和对照组裸鼠胫骨髓腔注入30微升A549细胞的悬液(约5x105个细胞),空白组注入30微升PBS。造模完毕,裸鼠继续养3-6周。利用X线片和组织学检测观察肿瘤造成的骨质破坏。利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法检测骨组织切片上的破骨细胞。结果:干扰组和对照组裸鼠各死亡2只。X线片显示,3周末干扰组裸鼠50%(5/10)而对照组裸鼠10%(1/10)出现溶骨性病灶;6周末干扰组裸鼠87.5%(7/8)而对照组裸鼠25%(2/8)出现溶骨性病灶。在各个时间段,干扰组溶骨性破坏比对照组严重。空白组未见明显变化。组织学检查显示,与对照组相比,干扰组裸鼠骨中肿瘤病灶面积更大,病灶数目更多,肿瘤对骨皮质侵蚀更严重。TRAP染色表明干扰组裸鼠肿瘤病灶周围破骨细胞数明显多于对照组。结论:胫骨髓腔注射法成功构建肿瘤骨转移裸鼠模型。慢病毒介导的Id1基因沉默造成了更明显的溶骨性破坏。Id1基因可能抑制肿瘤向骨转移。
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