人类的fascin基因,亦即fascin-1,定位于7p22,编码一种55kD的球形蛋白,结合捆绑细胞微丝F-Actin,主要在细胞的分裂增殖、变形与移动以及信号转导中发挥功能。本课题组以往曾率先研究发现,fascin是一个重要的新的癌基因,在食管癌的发生发展中显著异常过表达,在癌细胞的增殖与侵袭中发挥功能,与患者的不良预后相关,但过表达调控机制不明。本论文前期,我们曾研究确定,在食管癌细胞中,5′端转录调控区的?74~?41是fascin基因的核心启动子区段。在此基础上,为了进一步研究确定fascin基因的关键转录激活元件,在本论文中,首先,通过综合运用生物信息学分析、定点突变、双荧光素酶报告基因活性检测、电泳迁移率变动分析(EMSA)和super-EMSA等实验技术手段,进一步把fascin基因的关键转录激活元件所在位点,缩窄到-70~-60这一更短区段,重组表达的转录因子Sp1能够与之结合,而食管癌细胞的核蛋白提取物中也确实检测到了Sp1蛋白的表达。其次,通过联合应用基因过表达、RNA干扰、定量RT-PCR、western blot和报告基因活性检测等实验技术手段,从正反两个方面研究证明,转录因子Sp1不仅能够结合fascin基因的-70~-60区段序列,而且还能够激活fascin基因的mRNA转录和蛋白翻译。再次,为了鉴定出食管癌细胞中,磷酸化激活转录因子Sp1的上游激酶,针对不同细胞信号转导通路,在本论文中,分别用8种特异性激酶抑制剂处理食管癌细胞,然后检测fascin基因的表达变化或报告基因的活性改变。结果显示,在食管癌细胞中,只有MEK1/2的特异性抑制剂,不但能够使下游激酶ERK1/2和转录因子Sp1的磷酸化程度明显降低,而且还能够明显抑制fascin基因mRNA与蛋白的表达,或报告基因的活性。而与此同时,当应用RNAi使ERK1/2的表达下调时,也同样可导致fascin基因的表达显著降低。这些结果一致表明,食管癌细胞中,ERK1/2是直接磷酸化转录因子Sp1,激活fascin基因转录的上游激酶。最后,为了鉴定出激活食管癌细胞MEK1/2→ERK1/2→Sp1→fascin这一信号转导通路的细胞外活性分子,在本论文中,又分别研究了表皮生长因子EGF和转化生长因子TGF-β1对上述细胞信号转导通路的影响。结果显示,随着EGF(50 ng/ml)刺激时间的延长,从5 min到24 h,食管癌细胞fascin基因的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高;与此不同,TGF-β1 (10 ng/ml)的刺激,对食管癌细胞fascin基因的表达未见明显影响。而进一步的报告基因、EMSA、western blot及免疫共沉淀等实验结果显示,随着EGF刺激,Sp1与?70~?60核心元件的结合明显增加,fascin基因启动子的活性明显增强,同时磷酸化的ERK1/2和Sp1也相应明显增多;而如果预先用MEK1/2特异性抑制剂处理,阻断MEK1/2→ERK1/2细胞信号转导通路,然后再进行EGF刺激,则EGF诱导fascin基因表达的上述效果随之消失。这些实验结果共同说明,EGF是食管癌细胞中促进fascin基因过表达的重要细胞外活性分子,并且主要是通过激活MEK1/2→ERK1/2→Sp1这一细胞信号转导通路得以实现的。总结以上诸实验结果可见,本论文深入研究揭示食管癌细胞中fascin基因的过表达调控机制,主要结论包括:1)fascin基因的关键转录激活元件位于其5′端转录调控区?70~?60区段;2)fascin基因的转录激活因子是磷酸化的Sp1;3)食管癌细胞中,fascin基因的过表达主要由MEK1/2→ERK1/2→Sp1等细胞信号转导通路介导;4)EGF是激活食管癌细胞,使fascin基因过表达的细胞外活性分子。这不但有助于全面揭示癌基因fascin在食管癌细胞中的过表达调控机制,而且还十分有助于针对fascin及其相关细胞信号转导通路寻找干预食管癌发生发展的方法提供理论指导。