论文部分内容阅读
该研究从尖锐湿疣组织中克隆了HPV11L1基因,利用原核细胞表达HPV11L1主要衣壳蛋白,并将该地区流行株HPV16L1基因与HPV11L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统,为研制同时预防宫颈癌和尖锐湿疣等多种疾病的HPV16-11型基因工程疫苗奠定基础.方法:提取尖锐湿疣组织DNA,用感染常见的6、11、16、18型的特异引物进行PCR法筛选尖锐湿疣组织中感染的HPV11型DNA,并分析各型别之间的比例.进一步将4例标本中HPV11型L1基因进行克隆,构建克隆质粒pSP73-HPV11L1,测序分析其基因变异.将HPV11型L1本地株酶切后连接到原核表达质粒pBAD/B,构建原核表达系统pBAD-HPV11L1/Top 10,经酶切鉴定重组质粒的正确性.经L-Arobinose诱导后表达HPV11型L1蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.同时,对本地流行株HPV16L1基因进行亚克隆,构建pBluescriptHPV16L1克隆质粒,并对其测序.测序结果正确后,酶切HPV16L1,连接到pFastBacDual的强启动子phol后;从克隆质粒pSP73-HPV11L1切下HPV11L1,连接到pFastBacDual的弱启动子p10后,利用Bac to Bac系统在昆虫细胞Sf9中表达外源蛋白.SDS-PAGE和Westernblot鉴定HPV16L1和HPV11L1蛋白的表达量及特性,电镜证实昆虫细胞内有较大量的VLP的形成.将表达有外源蛋白的昆虫细胞收集,经超速离心后,收集1.29g/cm的区带,透析后定量.将VLP免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后,取血清检测其抗HPV16L1和HPV11L1的抗体水平.结论:该研究首次成功地克隆了该地区尖锐湿疣组织中HPV11型L1基因,并利用Bacto Bac系统构建重组病毒Bacmid/HPV16-HPV11L1.转染到Sf9昆虫细胞后重组外源蛋白得到高效表达,并经电镜证实昆虫细胞内存在较大量VLP.超速离心后的VLP免疫小鼠后,小鼠可获得抗16型和11型L1两种蛋白的血清抗体.为进一步制备基因工程多价疫苗奠定基础.