茜草为茜草科植物茜草Rubia Cordifolia L.的干燥根和根茎。主产于安徽、江苏、山东、河南、山西等地。茜草味苦性寒,善走血分,既能凉血止血,又能活血行血,可用于血热妄行或血瘀脉络之出血证,对于血热夹瘀的各种出血症,尤为适宜。能通经络,行瘀滞,可用于经闭、跌打损伤、风湿痹痛等血瘀经络闭阻之证。茜草为临床常用中药,常与小蓟、白茅根、侧柏、山栀子等配伍用于血热妄行之多种出血证,临床应用较为广泛。炒炭后寒性减弱,性变收涩,以止血为主。用于各种出血证。如吐血,咯血,血痢,尿血,崩漏下血等出血证。紫菀丸始载于《鸡峰普济方》,治吐血、咯血、嗽血:真紫菀、茜根等分。为细末,炼蜜为丸,如樱桃子大,含化一丸,不以时。目前对中药的研究并不仅仅局限于单味中药本身,临床中药发挥治疗治疗疾病的作用主要体现在中药之间的配伍应用,也是中药治疗疾病的特色。所谓饮片的生熟异用是指将单味药纳入复方、生熟饮片互换,进行研究配伍作用的异同。目前茜草和茜草炭在临床应用中存在混用的现象,处方应付不明确,为了规范茜草和茜草炭的临床合理用药,本文将茜草、茜草炭分别纳入到复方紫菀丸中,探讨茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血热出血大鼠模型和血瘀大鼠模型的不同影响,为茜草的生熟异用的合理性提供依据。本论文主要分为五个主要的部分,第一部分为文献研究,通过查阅相关文献,对茜草的炮制沿革,化学成分、药理作用及临床应用的研究进展进行总结。第二部分主要研究茜草、茜草炭的化学组分的差异,包括茜草、茜草炭化学成分的分离研究及运用UPLC-MS分析茜草炒炭前后化学成分的变化。第三部分为茜草炭质量标准方面的研究,包括茜草炭的炮制工艺研究和茜草炭中主要醌类物质的含量测定。第四部分为茜草、茜草炭与紫菀配伍对血热出血模型大鼠的影响。第五部分为茜草、茜草炭与紫菀配伍对血瘀模型大鼠的影响。实验具体研究内容如下:1文献研究通过查阅相关古今文献及国内外学者的研究成果,对本课题的研究对象茜草及茜草炭的炮制沿革、化学成分、药理作用和临床应用等方面资料进行总结,为茜草在复方中生熟异用的物质基础研究提供依据。2茜草、茜草炭化学组分差异性研究通过硅胶柱层析和NMR等光谱技术从茜草中分离并鉴定了 7个化合物,分别为:大叶茜草素(1)、甲基异茜草素(2)、1-羟基-2-甲基蒽醌(3)、β-谷甾醇(4)、茜草素(5)、羟基茜草素(6)、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-α-L-鼠李糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷(7);从茜草炭中分离出两个化合物分别为:1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌(8)、异茜草素(9)。通过运用UPLC-MS等方法分析比较茜草炒炭前后的化学成分,研究茜草炒炭前后产生主要变化的化学成分。通过比较分析发现,茜草炒炭前后变化最大的为蒽醌苷类化合物和苷元化合物及萘醌类大叶茜草素的相对含量。炒炭后蒽醌苷大多被破坏,蒽醌苷元相对含量明显升高,大叶茜草素的含量显著降低。3茜草炭炮制工艺和含量测定研究目前对茜草的含量测定已有很多相关的研究,但对茜草炒炭后含量测定的研究较少,本文建立了 UPLC法测定茜草炭中异茜草素、羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素含量的方法,此方法较HPLC法更加快速、准确,可以为茜草炭饮片质量标准的建立及茜草炭炮制工艺的优选提供参考。2010版《中国药典》中茜草炭的炮制方法为,取茜草片或段,照炒炭法炒至表面焦黑色,形如茜草片或段,表面黑褐色,内部棕褐色。气微,味苦、涩。但未对茜草炭的含量测定进行相关的规定,来控制茜草的质量。目前,茜草炭的炮制工艺没有一个统一的标准,影响着茜草炭在临床应用中疗效的发挥。经本课题组研究发现茜草在炒炭的过程中,一种蒽醌类物质1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌的含量明显增加,经进一步研究发现1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌能够抑制脂多糖对人脐静脉内皮细胞的损伤,对血管内皮细胞具有一定的保护作用。可见1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌与茜草炒炭后止血作用增强密切先关,可以作为优选茜草炭炮制工艺的指标性成分。本文采用高效液相色谱法,以蒽醌类成分1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌为指标,建立茜草炭的含量测定方法,并以此方法优选出茜草炭的最佳炮制工艺,为规范茜草炭的质量提供依据。4茜草、茜草炭与紫菀配伍对血热出血模型大鼠的影响4.1茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血热出血模型大鼠血液流变学及凝血酶活性的不同影响血热出血模型的大鼠全血黏度会有不同程度的升高、正常的血液循环也会受到相应的影响。生品复方中剂量和炭品复方中剂量能显著降低不同切变率下血热出血模型大鼠的全血黏度(P<0.05或P<0.01),这说明了茜草在复方中的运用发挥了其活血化瘀的功效,改善了血热出血大鼠的血液循环,茜草炭在复方中运用所体现出的改善血热出血大鼠异常血液循环的程度稍弱于茜草,但表现出了显著性影响,充分体现了“炒炭存性”的这一传统炮制理论,即茜草炒炭后不仅止血功能增强,还保留了一些原药材的功效。血浆黏度的明显增加反映了血液粘滞性增加,红细胞压积的显著增加说明了血液粘稠度增加,由于血热出血会导致血液的浓缩和血浆中水分的丢失,导致模型组大鼠的血红蛋白含量相对性增多。生品复方中剂量组只能够改善血热出血模型大鼠的血浆粘度,对血红蛋白和红细胞压积的异常升高没有显著性改善,而炭品复方中剂量组使血热出血模型大鼠异常的血浆黏度、血红蛋白含量和红细胞压积均得到了不同程度的改善。生品复方中、高剂量组能显著缩短TT(P<0.05或P<0.01),而炭品复方高、中、低剂量组均能显著缩短TT(P<0.05或P<0.01),说明生品复方和炭品复方都能够通过影响凝血酶形成阶段凝血时间来达到止血效果。生品复方中剂量组、炭品复方高、中剂量组均能显著缩短APTT(P<0.05或P<0.01),但炭品复方作用于凝血酶原酶形成阶段内源性途径而缩短血热出血模型大鼠凝血时间的趋势更加明显。生品复方低剂量组能显著延长PT(P<0.01),而炭品复方中剂量组能显著缩短PT(P<0.05),可以体现出茜草、茜草炭在复方紫菀丸中运用的区别,茜草生能凉血止血、活血化瘀,炒炭后止血作用增强的炮制理论。生、炭品复方均能提高FIB的含量(P<0.05或P<0.01),通过纤溶系统来促进凝血,但炭品复方的效果较生品复方显著。4.2茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血热出血模型大鼠肺、胃部病理性损伤的不同影响茜草生品复方、炭品复方都能通过改善血热出血模型大鼠肺泡间隔毛细血管扩张充血,纤维组织增生,肺间质出血,肺泡腔内有红细胞浸润,局部炎细胞浸润,部分肺泡结构被破坏等途径而对其肺病理组织损伤起到一定的治疗和恢复作用,且炭品复方的效果要强于生品复方。茜草生品复方、炭品复方的不同剂量组表现出对血热出血模型大鼠的胃粘膜组织损伤的不同方面的改善作用。通过对病理切片的考察,能够观察到病理组织的出血情况,进一步阐释了茜草、茜草炭在复方紫菀中所发挥止血作用的异同。4.3茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血热出血模型大鼠血小板系统的不同影响生品复方高、中剂量组能显著提高由ADP诱导血热出血模型大鼠的血小板聚集率,而炭品复方的高、中、低剂量组均能显著提高由ADP诱导血热出血模型大鼠的血小板聚集率(P<0.05或P<0.01),且炭品复方对血小板聚集率的影响强于生品复方。生品复方低、中剂量组可通过降低6-keto-PGF1的含量来达到止血效果,生品复方对TXB2的含量无显著性影响,反映出茜草在复方中也发挥其活血的作用。炭品复方的低、中、高剂量组均可降低6-keto-PGF1α的含量,且升高TXB2的含量,促进了血热出血模型大鼠的血管收缩和血小板的聚集,从而达到止血的效果,也充分体现了茜草炒炭后止血作用增强的传炮制理论。5茜草、茜草炭与紫菀配伍对血瘀模型大鼠的影响5.1茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血瘀模型大鼠血液流变学及凝血酶活性的不同影响模型组与空白相比,高、中、低切变率下全血黏度、血浆粘度的血液流变学指标均升高(P<0.05或P<0.01),能够反映红细胞有一定程度的聚集性和变形性的改变,血液黏滞性增强,表明血瘀模型复制成功。生品复方能够显著改善不同切变率下血瘀模型大鼠的全血黏度及血浆黏度,说明茜草在复方中充分发挥了活血化瘀的作用,能够显著地改善血瘀模型大鼠异常的血液流变性。炭品复方可以显著缩短PT、TT、APTT,FIB的含量显著增加(P<0.05或P<0.01),生品复方能够显著延长PT(P<0.05或P<0.01),生品复方中剂量组能够缩短TT、APTT,FIB的含量显著增加(P<0.05或P<0.01),说明炭品复方主要通过影响内、外源性凝血酶以及纤维蛋白原来达到促凝效果,而生品复方在止血方面体现了一定的双向调节,这与茜草生品用于化瘀止血,炒炭后主要用于止血,即茜草“生行熟止”有一定的关系。5.2茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血瘀模型大鼠肺、胃部病理性损伤的不同影响通过对肺病理切片的考察,茜草、茜草炭的应用能够用明显改善肺泡间隔毛细血管扩张充血、肺间质出血以及肺泡腔内红细胞的浸润等出血症状。通过对胃病理切片的考察,茜草、茜草炭的应用能够改善胃粘膜糜烂、胃粘膜内毛细血管及静脉扩张充血、以及炎症等症状,但彼此间的差异不是很明显。5.3茜草、茜草炭分别与紫菀配伍对血热出血模型大鼠血小板系统的不同影响炭品复方能明显提高血瘀模型大鼠血小板聚集率(P<0.01),进一步说明茜草炭在复方中的应用时通过多种凝血途径来发挥其止血作用。生品复方对由ADP诱导的血小板聚集率表现出一定的影响,但弱于炭品复方,这体现了茜草既能化瘀,又能止血的功效。血瘀模型大鼠血浆中TXB2的含量急剧升高,说明TXA2的含量显著升高,TXA2的含量显著升高能够导致血栓的形成,同时6-keto-PGF1α的含量明显降低,符合血瘀模型的特征。生品复方高、中、低剂量组通过显著降低TXB2的含量和升高6-keto-PGF1α的含量(P<0.01),来发挥茜草的化瘀作用。炭品复方虽能够显著降低TXB2的含量和升高6-keto-PGF1α的含量(P<0.01),但降低TXB2和升高6-keto-PGF1α的趋势不如生品复方明显,说明茜草炭主要发挥其止血作用,进一步论证了茜草、茜草炭“生行熟止”的传统炮制理论。