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木聚糖酶被用作重要的工业酶制剂,已经成熟应用在纸浆造纸、饲料加工、酿造等工业生产中。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖完全水解酶系中关键酶,其结构包括催化域、结合域、热稳定域及未知功能结构域等,催化采用内切水解方式,专一性作用主链分子中的β-1,4-糖苷键。为了成功实现酿酒酵母高效分泌木聚糖酶,本研究采用重叠延伸PCR法将组成型启动子PGK、外源蛋白分泌α-factor、木聚糖酶(xylanaseB,XynB)和终止子CYC1构建成PαXC表达盒。利用rDNA整合法将组成型表达载体pYES2-PαXC-rDNA整合到酿酒酵母基因组中,通过尿嘧啶营养缺陷型筛选获得阳性转化子,基于液滴数字PCR(digital polymerase chain reaction,ddPCR)法鉴定重组酿酒酵母菌株木聚糖酶基因的拷贝数,利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测不同拷贝数的木聚糖酶基因重组菌株的产酶活力,考察不同拷贝数的木聚糖酶基因与其酶活力之间的关系,对酶活力最高的重组菌株进行遗传稳定性研究,通过单因素分析和响应面法优化重组菌株产木聚糖酶的发酵条件,研究结果如下:1、利用重叠延伸PCR法成功构建了PαXC表达盒,rDNA整合法将组成型表达载体pYES2-PαXC-rDNA整合到酿酒酵母基因组中,嘧啶营养缺陷型筛选出大量阳性转化子。2、ddPCR法鉴定上述筛选获得的重组菌株木聚糖酶基因拷贝数,共获得1、2、3、6、7、8、10、14、17及21木聚糖酶基因拷贝数的10株重组菌。DNS法测定10株重组菌发酵产木聚糖酶活力表明,基因拷贝数与酶活力之间不呈正相关,木聚糖酶基因拷贝数为7时重组菌株(LX7)产木聚糖酶活力最高,酶活力可达355.03 U/mL,是单拷贝木聚糖酶基因产酶活力的6.4倍,木聚糖酶基因超过7拷贝时,酶活力反而下降。3、与本实验室保存的重组酿酒酵母工程菌产木聚糖酶活力相比,本实验构建的重组菌株产木聚糖酶活力高其47 U/mL,是其1.15倍。对LX7菌株进行遗传稳定性研究表明,rDNA整合木聚糖酶基因法获得的重组菌株产酶稳定性较好,经过6次传代后,酶活力变化较小,第6次传代时酶活力为349.5 U/mL。4、对高产木聚糖酶重组酿酒酵母工程菌的发酵条件进行单因素分析,方差分析结果表明,接种量、装液量、葡萄糖添加量对重组菌株发酵产木聚糖酶条件影响不显著,培养基初始pH、发酵温度、搅拌速度对重组菌株产木聚糖酶发酵条件影响显著。采用响应面法对LX7菌株发酵条件进行优化,结果表明重组菌株发酵产木聚糖酶的最优条件为:培养基初始pH为5.2,发酵温度为29℃,搅拌速度为180 rpm,LX7菌株发酵产木聚糖酶活力可达401.3 U/mL,较优化前提高了46 U/mL。