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几丁质酶是一种专一性降解几丁质的水解酶。在工业上,几丁质酶可用于制备功能性甲壳低聚糖;在农业上可作为生物控制剂,提高植物的抗病能力;在生物技术方面,可以用几丁质酶并辅以其它手段制备真菌原生质体,为细胞分子生物学提供工具酶。研究发现高等植物、鸟类、昆虫等动物及微生物都能够分泌几丁质酶类,但只有微生物几丁质酶具有开发应用的价值。本论文致力于从自然界中获得一株产几丁质酶菌株,从采集土样开始,进行了以下几个方面的研究:
1.用以几丁质为唯一碳氮源的平板培养基,从55份土样中共筛选到428株能产透明圈的菌株,再以透明圈与菌落直径比值的大小作为参考,结合摇瓶复筛,最终选取菌株 L<,012>为进一步实验菌株,其酶活力达 0.75U/mL;采用纸层析和离子色谱法对菌株L<,012>产几丁质酶的酶解产物进行分析,初步确定产物中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、以及聚合度小于10的寡糖。
2.通过对L<,012>菌落形态、菌丝体形态的观察,细胞壁氨基酸成分、全细胞糖成分的分析以及对其部分生理生化性质的考察,初步判断其属于类诺卡氏菌属。
3.通过对培养基组分的单因素实验和正交试验,确定了菌株L<,012>的最佳产酶培养基(g/L):细粉几丁质10,淀粉3,玉米浆3,NaNO<,3> 1.0,K<,2>HPO<,4> 1.05,KH<,2>PO<,4> 0.45,NaCl 0.1,MgSO<,4>·7H<,2>O 0.3,FeSO<,4>·7H<,2>O 0.03,pn 7.0;通过对发酵起始pH,培养温度,溶氧量,产酶时程,接种种龄以及接种量等培养条件的考察,确定了菌株L<,012>的最佳发酵产酶条件:起始pH:7.0,培养温度:30℃,发酵时程:48h,种龄:24h,摇瓶装液量:30mL,转速:180r/min,接种量:10﹪;条件优化后L<,012>菌株的产酶活力从原来的0.75U/mL,提高到2.31U/mL。
4.论文对菌株L<,012>粗酶性质进行了系统的研究,结果表明:菌株Lol2所产几丁质酶在4℃储存时稳定性好,三个月后依然保存有94﹪的酶活性;最适作用温度在45℃左右,在50℃以下热稳定性较好,超过65℃易失活;最适作用pH6.5,pH6.0~7.5范围内稳定性好,酸性环境下非常易失活,碱性条件下相对稳定;该酶可以耐受1.5mmol/L,的离子强度;Ag<+>,Fe<2+>,Ca<2+>,Mn<2+>对该酶有比较明显的激活作用,Hg<+>对酶活力有明显的抑制作用,Ca<2+>和Mg<2+>有轻微的抑制作用,NH<,4><+>对该酶活性有较强的抑制作用;表观米氏常数 Km为1.56×10<-5>mol/L,Vmax为2.887U/mL。