研究背景胃癌是临床常见的恶性肿瘤,2014年全世界大约有700000人死于胃癌,胃癌是导致死亡最多的肿瘤之一,尽管近年来一些新的治疗方法及药物被开发并应用于临床,但仍有大于50%的患者在术后五年内出现复发或远处转移导致死亡。其复发的主要原因目前尚不清楚。IL-17主要是由Th17细胞的一部分亚群细胞和中性粒细胞共同分泌产生的一种促进炎症发生发展的细胞因子(proinflammatory cytokine)。IL-17主要有155个氨基酸组成的相对分子质量为(15-22)×103的同型二聚体,N端为信号多肽。IL-17细胞因子家族中至少有6个成员,包括IL-17A亚型、IL-17B亚型、IL-17C亚型、IL-17D亚型、IL-17亚型E(又称为IL-25)和IL-17F亚型,其中IL-17A亚型是该细胞家族中的标志性细胞因子(hallmark cytokine)又称为IL-17或CTLA-8[1-3]。慢性炎症的种类复杂、表现形式各异例如炎症性肠病(inflammatory bowel diseases)、幽门螺杆菌的感染、乙肝病毒的感染和病源不明的各种前列腺炎均可致部分肿瘤的发生,称为炎症相关性肿瘤,而在这类肿瘤中都发现有IL-17表达增高。在我们前期研究中有部分内容关于IL-17的研究,其在胃癌组织中高表达IL-17,而且IL-17的表达程度与胃癌浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈现显著正相关,胃癌患者IL-17高表达在预后较差的患者中所占比例高,但IL-17是如何影响胃癌细胞侵袭转移的机制尚不清楚。有研究认为IL-17与上皮间质转化有一定的关系。肿瘤微环境是一个由肿瘤细胞,基质细胞,免疫细胞以及众多细胞因子组成的复杂环境,文献报道,肿瘤微环境中的炎性因子和炎症介质对肿瘤细胞的侵袭转移也发挥着重要影响。一方面,肿瘤细胞等能够通过激活机体免疫系统,一些炎性因子发挥着抑制肿瘤的作用;另一方面,炎性因子可以促进血管新生,激活某些信号途径,促进肿瘤细胞侵袭转移。有研究认为,肿瘤的侵袭转移可能与上皮间质转化有联系,但在胃癌中IL-17与EMT的关系尚未阐明。上皮间质转化是一个上皮细胞失去上皮特性,同时获得间皮特性,并且具有运动能力的生物学变化过程。该过程的发生形态学的改变,与细胞的分子水平的变化有关。最近大量研究证实,上皮间质转化与肿瘤侵袭转移有着密切的关系,细胞与细胞之间粘连的能力降低,细胞与细胞的基质粘附能力减弱,运动能力增强,但是否是有炎症因子的作用并未深入研究。现有的研究表明il-17在乳腺癌、前列腺癌中与emt的关系已部分阐明。这些特征的改变均可为侵袭转移提供条件,鉴于此过程在侵袭转移的重要作用,阐明上皮间质转化影响因素对于研究肿瘤的侵袭转移有重要意义。基于il-17在胃癌侵袭转移和上皮间质转化中的重要作用,我们推测il-17可能影响胃癌侵袭转移能力,促进胃癌细胞发生上皮间质转化。在本研究中,我们采用体外细胞模型,通过划痕实验、细胞侵袭实验、pcr、wb等方法研究il-17对胃癌细胞侵袭转移能力及上皮间质转化以的影响。研究方法1.不同浓度il-17对胃癌细胞形态学变化的影响选取sgc-7901细胞以及mgc-803细胞作为实验细胞。加入终浓度为0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml的il-17。细胞培养48小时,拍照记录细胞在il-17作用下形态学的变化。观察细胞在形态学的变化的程度,选择形态学变化最明显的浓度进行下一步实验。2.il-17对胃癌细胞迁移运动能力的影响划痕实验方法用来测试两株胃癌细胞迁移运动能力:实验组加入100ng/ml浓度il-17培养48小时,对照组加入等量pbs培养,进行划痕操作,记录划痕宽度。再培养24小时,再次记录两组划痕宽度。3.il-17对胃癌细胞侵袭能力的影响transwell小室细胞侵袭实验方法用来检测两株胃癌细胞侵袭能力:选取重悬细胞,实验组加入100ng/ml浓度的il-17,对照组加入等体积pbs,培养48小时。将细胞接种到transwell小室上室,下室加入含胎牛血清,再放入培养箱中培养24小时。取出transwell小室,洗净后,固定,染色,计数。4.il-17对胃癌细胞n-cadherin、e-cadherin和vimentinmrna表达的影响real-timepcr实验方法运用来检测两株胃癌细胞mrna表达,实验组加入100ng/ml浓度的il-17,对照组加入等体积pbs,培养48小时。提取细胞总rna,逆转录,进行检测n-cadherin、e-cadherin、vimentin在mrna的表达。5.il-17对胃癌细胞n-cadherin、e-cadherin和vimentin蛋白表达的影响westernbolt检测法运用来测定两株胃癌细胞蛋白表达量,实验组分别加入100ng/ml浓度的il-17,对照组加入等体积pbs,培养48小时。提取细胞总蛋白,进行e-cadherin,n-cadherin,vimentin在蛋白水平的表达。结果:1.不同浓度il-17对胃癌细胞形态学变化的影响结果表明:在il-17对胃癌细胞的细胞形态影响实验中我们发现,il-17处理过后的细胞形态发生变化,呈浓度依赖性,以100ng/ml的il-17处理过后,24小时对细胞形态影响最大,可以观察到细胞间粘附降低,细胞由多角形态变成梭型,部分细胞变圆,甚至呈悬浮状态。2.il-17对胃癌细胞迁移能力的影响结果表明:sgc-7901胃癌细胞实验组划痕宽度0.41±0.09mm,对照组划痕宽度0.71±0.09mm,(p=0.0188)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞迁移运动能力显著强于对照组。mgc-803胃癌细胞实验组划痕宽度0.40±0.15mm,对照组划痕宽度0.76±0.13mm,(p=0.0364)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞迁移运动能力显著强于对照组。3.il-17对胃癌细胞侵袭能力的影响结果表明:sgc-7901胃癌细胞实验组穿膜细胞数170±15个,对照组穿膜细胞数131±14个,(p=0.0331)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞侵袭能力显著强于对照组。mgc-803胃癌细胞实验组穿膜细胞数159±28个,对照组穿膜细胞数94±18个,(p=0.0297)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞侵袭能力显著强于对照组。4.il-17对胃癌细胞n-cadherin、e-cadherin和vimentinmrna表达的影响结果表明:sgc-7901胃癌细胞e-cadherinmrna相对表达量实验组0.81±0.14,对照组0.97±0.16,(p=0.0222);n-cadherinmrna相对表达量实验组1.16±0.12,对照组0.71±0.13,(p=0.014);vimentinmrna相对表达量实验组1.51±0.22,对照组0.81±0.13,(p=0.0096)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞e-cadherin表达水平显著低于对照组,n-cadherin和vimentin表达水平显著高于对照组。mgc-803胃癌细胞e-cadherinmrna相对表达量实验组0.45±0.13,对照组1.06±0.23,(p=0.0189);n-cadherinmrna相对表达量实验组1.36±0.20,对照组0.89±0.13,(p=0.0289);vimentinmrna相对表达量实验组1.51±0.22,对照组1.23±0.41(p=0.0431)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞e-cadherin表达水平显著低于对照组,n-cadherin和vimentin表达水平显著高于对照组。5.il-17对胃癌细胞n-cadherin、e-cadherin和vimentin蛋白水平的影响结果表明:SGC-7901胃癌细胞E-cadherin蛋白相对表达量实验组1.08±0.37,对照组1.82±0.22,(P=0.0418);N-cadherin蛋白相对表达量实验组1.42±0.22,对照组0.84±0.16,(P=0.0209);Vimentin蛋白相对表达量实验组1.65±0.27,对照组0.95±0.10(P=0.0146)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞E-cadherin表达水平显著低于对照组,N-cadherin和Vimentin表达水平显著高于对照组。MGC-803胃癌细胞E-cadherin蛋白相对表达量实验组0.86±0.17,对照组1.56±0.29,(P=0.0238);N-cadherin蛋白相对表达量实验组1.41±0.35,对照组0.77±0.15,(P=0.0441);Vimentin蛋白相对表达量实验组1.01±0.12,对照组0.56±0.17,(P=0.0227)。两组间比较有显著差异,实验组胃癌细胞E-cadherin表达水平显著低于对照组,N-cadherin和Vimentin表达水平显著高于对照组。结论:1.IL-17可以显著改变胃癌细胞的形态,以及显著增强胃癌细胞的侵袭转移能力。2.IL-17可以显著降低胃癌细胞上皮标志物E-cadherin的表达水平,以及显著增强间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平,从而增加胃癌细胞上皮间皮转换。3.上皮间质转化是IL-17促进胃癌细胞侵袭转移的重要机制之一。