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近年来,高分子材料聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸(PEG-PLGA)因具有良好的生物相容性和生物可降解性而作为多肽、蛋白质、质粒DNA疫苗的载体,在疫苗载药系统里成为了研究热点。纳米粒一般是指粒径10～1000nm的颗粒,PLGA纳米粒包裹抗原在注射局部起到储库效应并增强吞噬细胞摄取,而PEG-PLGA纳米粒则具有良好的透粘膜性能,可用于粘膜免疫疫苗的载体。目前研究表明,在高分子载体表面修饰阳离子可以增强载体的佐剂效应以诱导更强的免疫反应。鱼精蛋白(PS)是FDA批准使用的富含精氨酸的带正电荷蛋白质,鱼精蛋白包覆的PLGA微球作为疫苗载体可以有效诱导CD4+T细胞活化,但有关表面包覆鱼精蛋白的PLGA纳米粒或PEG-PLGA纳米粒用于疫苗载体尚无研究报道。本研究采用鱼精蛋白表面包覆PLGA、PEG- PLGA纳米粒,探讨其对小鼠骨髓源性树突细胞(BMDC)表型、BMDC摄取、BMDC细胞因子分泌及抗原交叉递呈作用的影响。完成的主要研究工作有：(1)复乳溶剂挥发法制备PLAG纳米粒和PEG-PLGA纳米粒,采用单因素方法以PLGA为载体材料,以卵清白蛋白(OVA)为模型药物,并以纳米粒粒径、多分散系数(PDI)、表面电位、包封率和载药量为考察指标,进行制备处方的优化筛选。当药物浓度为100mg/mL,载体用量为50 mg/mL,内水相与有机相体积比(W1/0)为1：5,有机相与外水相体积比(O/W2)为1：20,乳化剂PVA浓度为0.5%,超声乳化功率为600 W时,制备的OVA-PLGA纳米粒粒径303.3±6.1 nm,Zeta电位-7.36±1.02mV,PDI 0.113±0.031,包封率62.46±0.32%,载药量23.80±0.09%；OVA-PEG-PLGA纳米粒粒径271.4±9.2 nm,Zeta电位-6.04±0.23 mV,PDI 0.311±0.032,包封率61.51±2.9%,载药量23.51±0.85%。用鱼精蛋白分别与制备得到的PLGA纳米粒和PEG-PLGA纳米粒共同搅拌进行表面物理包覆,得到鱼精蛋白包覆的OVA-PLGA纳米粒(OVA-PLGA/PS)粒径347.0±10.6 nm,Zeta电位8.01±1.05 mV,PDI 0.144±0.034；鱼精蛋白包覆的OVA-PEG-PLGA纳米粒(OVA-PEG-PLGA/PS)粒径341.2±55.8 nm,Zeta电位8.48±3.42 mV,PDI 0.165士0.080。在透射电镜观察时,各种纳米粒形态规整,分散性好。以上包裹OVA的纳米粒主要用于研究BMDC吞噬纳米粒后表型变化、细胞因子分泌和交叉递呈实验。本研究还按照不同研究目的制备了用于研究BMDC摄取的FITC-OVA-PLGA、FITC-OVA-PEG-PLGA、FITC-OVA-PLGA/PS和FITC-OVA-PEG-PLGA/PS纳米粒；用于研究BMDC摄取后细胞内分布的OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA、OsO4-PLGA/PS和OsO4-PEG-PLGA/PS纳米粒,其Zeta电位在包覆鱼精蛋白后均呈由负到正的转变。(2)分离、诱导分化BMDC并进行形态学和表型的鉴定,结果显示在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)联合刺激的作用下,骨髓干细胞成功分化为BMDC,其纯度为85～95%(CD11c+)。BMDC培养体系的成功建立为实验的顺利开展提供了重要保障。本研究观测了前述各种纳米粒对BMDC表面分子(CD80、CD83、CD86、MHCI、MHCⅡ)表达的影响,发现OVA-PLGA/PS可以显著促进BMDC表面分子表达水平的增高,而OVA-PEG-PLGA/PS可显著促进除CD80之外的BMDC表面分子表达。研究了前述各种纳米粒对BMDC分泌细胞因子IL-4、IL-10和IL-12p70的作用,发现OVA-PLGA/PS可以显著增加BMDC分泌IL-12p70并显著减少分泌IL-4,而OVA-PEG-PLGA/PS可以显著增加BMDC分泌IL-4。以上结果表明,PS包覆对不同高分子纳米粒可能起到不同的刺激BMDC的作用。对PLGA纳米粒而言,PS包覆可以促进其诱导BMDC分泌Th1极化细胞因子(IL12p70),而对PEG-PLGA纳米粒而言,PS包覆主要促进其诱导BMDC分泌Th2极化细胞因子(IL-4)。(3)通过流式细胞术研究了BMDC对包裹FITC偶联OVA各种纳米粒的摄取特征。发现鱼精蛋白包覆的PLGA纳米粒(FITC-OVA-PLGA/PS、FITC-OVA-PEG-PLGA/PS)可以显著增强BMDC的摄取,且FITC-OVA-PLGA/PS对摄取的促进作用更加显著。这种摄取在37℃条件下,随时间延长而增加,呈时间依赖性,但在低温(4℃)时,摄取增加不明显,说明鱼精蛋白包覆纳米粒的摄取方式为能量依赖性的内吞方式。(4)通过将高电子密度的OsO4包裹入PLGA、PEG-PLGA纳米粒内,表面包覆(OsO4-PLGA/PS、OsO4-PEG-PLGA/PS)或不包覆鱼精蛋白(OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA),并使用透射电镜观测经BMDC摄取后,纳米粒在BMDC内细胞器的分布。研究发现鱼精蛋白包覆的纳米粒(OsO4-PLGA/PS、OsO4-PEG-PLGA/PS)正在和BMDC吞噬囊泡壁接触；而未用鱼精蛋白包覆的纳米粒(OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA)则未观察到与BMDC吞噬囊泡相互作用的现象。表明鱼精蛋白包覆可能通过促进纳米粒与BMDC吞噬囊泡膜的相互作用而促使纳米粒的溶酶体逃逸。(5)通过CD8+T细胞B3Z T杂交瘤细胞进行BMDC对纳米粒包裹OVA的交叉递呈作用的研究。着重研究了鱼精蛋白包覆纳米粒(OVA-PLGA/PS和OVA-PEG-PLGA/PS)对BMDC交叉递呈的影响,发现OVA-PLGA/PS的促进能力最强。此外,考察了鱼精蛋白包覆纳米粒在不同剂量、不同孵育时间下对BMDC交叉递呈的影响,发现OVA-PLGA/PS在浓度50～300μg/mL、孵育时间2-8 h内对BMDC交叉递呈的影响分别呈浓度依赖性及时间依赖性；而OVA-PEG-PLGA/PS在浓度50～400μg/mL、孵育时间2-10 h内对BMDC交叉递呈的影响分别呈浓度依赖性及时间依赖性。综上所述,本研究结果表明鱼精蛋白包覆的纳米粒(PLGA/PS、PEG-PLGA/PS)可以增加BMDC吞噬、促进BMDC成熟、刺激BMDC细胞因子分泌、增强BMDC对外源性抗原的交叉递呈作用,这也表明鱼精蛋白包覆纳米粒在注射免疫及粘膜免疫途径中均有作为引起细胞免疫的疫苗载体的作用。本研究结果在一定程度上探讨了鱼精蛋白包覆纳米粒作为疫苗载体的机制,并为制备阳离子包覆的高分子纳米粒疫苗载药系统提供了实验依据,在本文的研究基础上,有必要对鱼精蛋白包覆纳米粒疫苗转运系统在体内的抗原释放动力学与组织分布规律及免疫方式作进一步研究。