金黄色葡萄球菌是重要的医院和社区获得性感染菌，所引发疾病谱广泛，可以是皮肤感染，也可致心内膜炎、菌血症等致死性疾病。自二十世纪七十年代中期以来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，MRSA)已成为英格兰、美国、澳大利亚及爱尔兰等国大规模感染暴发的重要原因[1]。近二十年来，遏制MRSA播散己成为医院感染首要解决的问题[2]。 随着近年来包含金黄色葡萄球菌在内所引起的多种传染性疾病在全球所呈现的上升趋势，抗菌药物的使用越来越广泛，越来越大的抗菌药物选择压力下所出现的耐药机制复杂多样，新的耐药基因型和复合耐药基因型将不断出现。而耐药基因在病原微生物之间的扩散，以及不同的抗菌药物使用习惯可能导致细菌具有不同的地区特征性的耐药基因型分布。因此，明确地区性细菌耐药模式对该地区细菌感染的有效治疗与控制具有重要的指导价值。 目前，临床上主要通过检测细菌耐药表型确定其耐药模式，然而，此类传统的耐药表型检测，耗时且不能检测出因故未能表达的耐药基因。而PCR技术可从分子水平明确细菌耐药机制，但常规单重PCR反应每次只能检测细菌的一种耐药基因；因而，能同步检测复合耐药基因型的多重PCR快速检测体系，简便、快捷、有效，目前已成为探究临床菌株耐药分子机制及监测临床耐药基因型分布的重要手段之一，是临床药敏试验的重要补充，对耐药菌株的临床用药具有重要的指导意义。 目的： 为了解广州地区分离的金黄色葡萄球菌对常用抗菌药物β-内酰胺酶抗菌药物、大环内酯类-林可酰胺类.链阳霉素B类抗菌药物(MLSB)和氨基糖甙类药物耐药相关基因型的分布规律，以指导临床用药，本研究基于金黄色葡萄球菌耐药基因mecA(determinantofmethicillinresistance，甲氧西林耐药决定因子)、ermA、ermC(erm:erythromycinribosomemethylase，红霉素核糖体甲基化酶)、acc(6)-Ie+aph(2")(aac:aminoglycosideacetyltransferases，氨基糖苷乙酰转移酶，aph:aminoglycosidephosphotransferases，氨基糖苷磷酸转移酶)、ant(4)-Ia(ant:aminoglycosidenucleotidyltransferases，氨基糖苷核苷转移酶)和aph(3)-Ⅲa以及内参照基因16SrRNA，构建了多重PCR快速检测体系，并对自广州地区临床标本分离的124株金黄色葡萄球菌进行临床应用评价。 方法： 1.自GenBank获取目前全球已报道的金黄色葡萄球菌耐药相关基因mecA、ermA、ermC、acc(6)-Ie+aph(2")、ant(4)-Ia和aph(3)-Ⅲa及其内参照基因16SrRNA序列，利用DNAMAN、Lasergene、VectorNTI等多种生物信息学分析软件和BLAST等网上数据分析平台进行综合分析，以锚定、设计各耐药基因特异性的PCR检测靶片段及其多重检测引物对。 2.自广州地区临床标本分离的124株金黄色葡萄球菌，按照《全国临床检验操作规程》[3]分离菌株；利用PHOENIX-100及VITEK-60微生物自动鉴定系统进行菌株鉴定；采用苯唑西林-4％NaCl琼脂筛选法进行金黄色葡萄球菌耐甲氧西林表型的检测[4]；以红霉素诱导克林霉素耐药实验(D-试验)检测克林霉素诱导耐药啼[5]；以琼脂扩散法(改良Kirby-Bauer法)进行氨基糖甙类抗菌药物表型的检测；以改良的小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA。 3.以所设计的耐药基因多重检测引物对，优化组合以构建四重、七重PCR快速检测体系，并对已经传统药敏方法检测的124株金黄色葡萄球菌进行相关耐药基因的检测分析。 4.采用SPSS13.0统计软件进行数据的统计学处理。 结果： 1.金黄色葡萄球菌耐甲氧西林表型检测结果：124株金黄色葡萄球菌经苯唑西林一盐琼脂筛选法检测，73株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，阳性率58.9％。 2.金黄色葡萄球菌耐药表型检测结果：红霉素、克林霉素、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星耐药率分别为：71.0％(88/124)、66.1％(82/124)、58.9％(73/124)、25.0％(31/124)、64.5％(80/124)、53.2％(66/124)。 3.红霉素诱导克林霉素耐药实验(D-试验)结果：88株红霉素耐药金黄色葡萄球菌中，14株为诱导型耐药，D-试验阳性率15.9％。 4.成功构建β-内酰胺抗菌药物耐药基因mecA、MLSB耐药基因ermA、ermC及内参照基因16SrRNA的金黄色葡萄球菌四重PCR快速检测体系1。用于临床分离的124株金黄色葡萄菌耐药基因型分布检测，mecA、ermA、ermC检出率分别为59.7％(74/124)、50.096(62/124)、33.9％(42/124)；73株MRSA均检测出mecA基因；在88株耐红霉素金黄色葡萄球菌中，62株携带ermA基因，40株携带ermC基因，16株同时携带ermA、ermC基因；克林霉素诱导耐药菌株主要是ermC基因介导，14株诱导试验阳性金黄色葡萄球菌中，10株菌检测出ermC基因。 5.成功构建氨基糖甙类抗菌药物耐药基因acc(6)-Ie+aph(2")、ant(4)-Ia和aph(3)-Ⅲa及内参照基因16SrRNA的金黄色葡萄球菌四重PCR快速检测体系2。用于临床分离的124株金黄色葡萄菌耐药基因型分布检测，acc(6)-Ie+aph(2")、aph(3)-Ⅲa和ant(4)-Ia检出率分别为62.1％(77/124)、32.3％(40/124)和1.6％(2/124)；所有庆大霉素、奈替米星以及阿米卡星耐药的金黄色葡萄球菌菌株均检测到上述三个耐药基因中的一个或一个以上；80株妥布霉素耐药金黄色葡萄球菌有5株菌未能检出耐药基因；74株mecA阳性菌株有72株(97.3％)检测到acc(6)-Ie+aph(2")基因。 6.进一步优化多重PCR反应条件，基于上述四重PCR反应体系，初步构建耐药基因mecA、ermA、ermC、acc(6)-Ie+aph(2")、ant(4)-Ia和aph(3)-Ⅲa及内参照基因16SrRNA七重PCR快速检测体系。 结论： 1.成功构建金黄色葡萄球菌耐药基因多重PCR快速检测体系，能高效、快速地分别检测其常用抗菌药物β-内酰胺抗菌药物、大环内酯-林可酰胺类-链阳菌素B及氨基糖甙抗菌药物相关耐药基因mecA、ermA、ermC、acc(6)-Ie+aph(2")、aph(3)-Ⅲa和ant(4)-Ia，其对耐药基因型的检测判定与传统菌株耐药表型的分析具有很好的相关性。 2.在广州地区分离的124株金黄色葡萄球菌中，mecA和ermA、ermC是引起β-内酰胺抗菌药物和大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素B类抗菌药物耐药的主要分子机制。诱导型MLSB耐药菌株以携带ermC基因为主；而编码AAC(6)-APH(2")双功能酶的acc(6)-Ie+aph(2")基因是金黄色葡萄球菌最重要的氨基糖甙类抗菌药物耐药基因，其次为aph(3)-Ⅲa，ant(4)-Ia则少见。 3.该多重PCR快速检测体系的建立，尚为进一步建立耐药基因型高通量、低密度的液相芯片检测技术体系奠定了一定的工作基础。