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电针具有良好的镇痛效应,已广泛应用于多种疾病,特别是疼痛性疾病的治疗。在临床上,人们发现反复或持续电针会引起电针镇痛效应下降,即电针耐受。电针耐受是针刺治疗的一种负效应,引起了临床工作者和研究人员的极大关注。大量的研究表明电针在诱导阿片物质(脑啡肽、内啡肽等)释放,产生镇痛的同时,可引起抗阿片物质(如胆囊收缩素、孤啡肽、血管紧张素II等)的释放增加。尽管这些研究阐明了这些活性物质的作用及其相互间的关系,电针耐受的机制仍不清楚。研究表明电针与吗啡有交叉耐受现象。人们在研究吗啡耐受时发现micro RNA(mi RNA)与兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAAT)均参与吗啡耐受。然而,mi RNA和EAAT是否参与电针耐受尚无报道。因此,本研究旨在探索mi RNA与EAAT在电针耐受中的作用。1.电针耐受大鼠模型的建立筛选单次电针后痛阈升高50%的SD大鼠(有效鼠)用于正式实验。将60只有效鼠(250±20 g)随机分为3组,每组20只:电针组,对照组和假针组。电针组大鼠每天电针1次,连续电针8 d;对照组大鼠仅做保定处理;假针组大鼠只扎针、不通电。采用鼠尾光照测痛法测定大鼠痛阈。记录电针前后的大鼠痛阈,计算每次电针的痛阈变化率。结果显示,对照组与假针组的大鼠痛阈变化率无显著差异(p>0.05)。电针组大鼠的痛阈变化率随着电针次数的增加而下降(p<0.05);电针组大鼠的痛阈变化率在第1至6天高于(p<0.05)对照组,在第7、8天与对照组无差异(p>0.05)。提示电针耐受的形成。2.电针耐受大鼠下丘脑mi RNA的差异表达为探索下丘脑mi RNA在电针耐受中的作用,本研究采取电针耐受大鼠下丘脑进行高通量深度测序,运用q PCR方法对测序结果进行验证,并进一步通过侧脑室微注射技术对深入研究差异mi RNA在电针耐受中的作用。在mi RNA深度测序实验中,选取两窝雄性有效鼠(250±20 g),每窝6只,共计12只。将大鼠分为两组,即电针组和对照组。按照配对实验方法进行同窝配对,每对大鼠中一只接受电针,另一只接受对照处理。电针组大鼠接受每天1次、连续8 d电针。第8天电针后迅速处死,取下丘脑。其中同组同窝的3只大鼠样品混合为一个样品池(即每组样品两个样品池),进行测序建库。利用高通量深度测序技术和生物信息学方法分析电针组与对照组间的mi RNA差异表达,并对差异表达mi RNA进行靶基因预测和功能富集分析。在q PCR验证实验中,选取9只雄性有效鼠(250±20 g),随机分为3组,即对照组、电针组和假针组,每组3只。电针组大鼠接受每天1次、连续8 d电针。第8天电针后迅速处死,取下丘脑、丘脑、海马,分别采用q PCR法对差异mi RNA进行验证。选取测序结果中表达量最高的12个差异mi RNA进行验证。在侧脑室注射验证实验中,选取132只雄性有效鼠(250±20 g),随机分为两组,即电针组与对照组,每组66只。各组大鼠分别接受侧脑室注射4种agomir(ago-7a-5p、ago-204-5p、ago-148a-3p、ago-370-3p),4种antagomir(antago-let-7b-5p、antago-107-3p、antago-124-3p、antago-221-3p),negative agomir,negative antagemir或生理盐水(每6只大鼠注射同一种药物)。注射后,电针组大鼠接受每天1次、连续8 d电针,并于每次电针前后测定痛阈,计算痛阈变化率。Mi RNA深度测序结果显示:测序分析共得到49个差异表达mi RNA。电针组中34个mi RNA表达下调,15个mi RNA表达上调。这些差异mi RNA可能通过MAPK通路、神经营养因子、脂肪酸代谢等通路,以及神经冲动传导、受体信号通路和基因表达调节等生物学机制参与电针耐受。进一步QPCR验证结果显示,电针组大鼠下丘脑中,mi R-124-3p、mi R-221-3p、mi R-let-7b-5p和mi R-107-3p上调(p<0.05),mi R-7a-5p、mi R-148a-3p、mi R-204-5p、mi R-370-3p、mi R-434-5p和mi R-344b-3p下调(p<0.05),与高通量测序结果基本一致,印证了测序结果的可靠性。电针组大鼠丘脑中,5个mi RNA上调(p<0.05),4个mi RNA下调(p<0.05)。电针组大鼠海马中,5个mi RNA上调(p<0.05),2个mi RNA下调(p<0.05)。这些mi RNA在不同部位表达水平有所差异,提示在电针耐受过程中,mi RNA的表达存在区域特征。侧脑室注射实验的结果显示:电针组中,注射agomir-148a-3p的大鼠在4~8 d、注射agomir-370-3p的大鼠在6~8 d、注射antagomir-let-7b和antagomir-107-3p的大鼠在3~8 d,以及注射antagomir-124-3p的大鼠在2 d和6~8 d的痛阈变化率高于(p<0.05)电针+生理盐水组,提示mi R-148a-3p、mi R-370-3p、let-7b-5p、mi R-107-3p以及mi R-124-5p参与电针耐受。3.电针耐受大鼠脊髓谷氨酸转运体的表达时程变化为探索脊髓EAAT在电针耐受中的作用,本研究采用q PCR和western blot方法检测电针耐受过程中脊髓EAAT的动态表达,并通过鞘内注射EAAT激动剂(利鲁唑),观察EAAT活性增强后对电针耐受的影响。为确定电针后的最佳采样时间,本研究先测定了单次电针后的脊髓EAAT表达时程。选取36只有效鼠(250±20 g)进行单次电针,分别于电针前(0 h)和电针后0.5、1、2、4、8 h采取脊髓L4-5段,检测三种脊髓EAAT的动态表达,包括L-谷氨酸-L门冬氨酸转运体(L-glutamate-L-aspartate transporter,GLAST),谷氨酸转运体1(glutamate transporter1,GLT-1)和兴奋性氨基酸转运体1(excitatory amino-acid carrier 1,EAAC1)。并将其表达峰值时间点作为后续采样时间点的依据。为探索反复电针对脊髓谷氨酸转运体表达时程的影响,选取120只有效鼠(250±20 g),随机分两组,即电针组与假针组,每组60只。电针组大鼠接受每天1次、连续8 d电针,并于电针前后测定痛阈,计算痛阈变化率。各组大鼠随机选取12只,分别于电针前(0 d)和电针后2、4、6、8 d采取脊髓L4-5段,检测EAAT表达;其中6只大鼠在电针后2 h采样,用于检测GLAST与GLT-1的表达;另6只在电针后4 h采样,用于检测EAAC1的表达。为探索鞘内注射利鲁唑(EAAT激动剂)对电针耐受的影响,选取36只有效鼠,随机分为6组:电针+溶剂组、电针+5μg利鲁唑组、电针+10μg利鲁唑组、电针+20μg利鲁唑组、溶剂组、20μg利鲁唑组,每组6只大鼠。其中电针组大鼠接受每天1次、连续8 d电针;利鲁唑处理组的大鼠在每次电针前注射利鲁唑。每日电针前后测定大鼠痛阈,并计算痛阈变化率。单次电针的实验结果显示,与0 h相比,GLAST与GLT-1的基因表达在各时间点无显著变化(p>0.05),而蛋白表达在2、4和8 h升高(p<0.05),并于4 h达到峰值。EAAC1的基因表达在电针后1、2、4、和8 h升高(p<0.05),蛋白表达在2、4和8 h升高(p<0.05),并于2 h达到表达峰值。因此,在反复电针实验中,检测GLAST与GLT-1的样品在电针后4 h采取,而检测EAAC1的样品在电针后2 h采取。反复电针的实验结果显示,GLAST与GLT-1的基因表达与假针组相比无显著差异(p>0.05),而EAAC1的基因表达在第2、4天高于(p<0.05)假针组,第8天低于(p<0.05)假针组。三种脊髓EAAT的蛋白表达均随电针次数的增加而下降,并与痛阈变化率呈正相关(p<0.05)。至第8天时,三种脊髓EAAT的蛋白表达与假针组无差异(p>0.05)。进一步的鞘内注射实验结果显示,电针+20μg利鲁唑组的痛阈变化率在第4~8天高于(p<0.05)电针+溶剂组,电针+10μg利鲁唑组的大鼠痛阈变化率在第5~8天高于(p<0.05)电针+溶剂组,而电针+5μg利鲁唑组的大鼠痛阈变化率与电针+溶剂组无显著差异(p>0.05)。提示鞘内注射利鲁唑可剂量依赖性地部分逆转电针耐受的形成。这些结果提示脊髓EAAT参与电针耐受。