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研究背景及目的：越来越多研究显示组成型激活脂质的生物合成,尤其是饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)和单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)是肿瘤发生发展中的关键事件,提示脂质代谢途径可能是肿瘤干预的有价值的分子靶点。酰基-辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)是△9脂肪酸去饱和酶异构体,能将SFA转换为MUFA。在人类主要存在2种异构体(SCD-1和SCD-5),其中SCD-1在成人多数组织有表达,但主要在肝脏中；而SCD-5表达于人胚胎组织和成人脑组织。最近,许多研究集中在SCD-1与肿瘤发生发展关系的研究中,SCD-1在肝癌和结肠癌中呈现高表达,但在前列腺癌组织呈现出相反的结果。此外,在慢性髓细胞样白血病中SCD-1扮演抑癌基因的作用,这些研究结果充分表明SCD-1在肿瘤发生发展中发挥极其重要的作用。然而,迄今为止,尚未见SCD-1在食管鳞癌中的研究报道。本研究检测食管鳞癌组织和细胞中SCD-1mRNA和蛋白的表达,分析其表达与临床病理学参数之间的关系,采用RNA干扰技术下调食管鳞癌细胞中SCD-1mRNA和蛋白的表达,研究其表达下调对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨其可能的分子机制,期望为以SCD-1为靶点的食管鳞癌基因治疗提供理论依据。第一章SCD-1mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其与临床病理学参数之间的关系材料和方法:1.采用原位杂交检测60例食管鳞癌组织和相对应的60例正常食管粘膜组织中SCD-1mRNA的表达。2.采用免疫组织化学技术检测60例食管鳞癌组织和相对应的60例正常食管粘膜组织中SCD-1蛋白的表达。3.统计学处理：采用SPSS17.0软件分析,采用x2和相关性分析检验所获得的实验数据,P<0.05表示有统计学意义。研究结果：1.原位杂交结果表明,SCD-1mRNA在食管鳞癌组织中表达的阳性率为68.33%,显著高于正常食管粘膜组织(20.00%),且差异具有统计学意义(x2=28.420,P=0.000)。2.免疫组织化学结果显示,SCD-1蛋白在食管鳞癌组织中表达的阳性率(63.33%)也显著高于正常食管粘膜组织(16.67%),且差异具有统计学意义(x2=27.222,P=0.000)。3.SCD-1mRNA和蛋白在食管鳞癌中的表达呈正相关(γ=0.523,P=0.000)。4.SCD-1mRNA和蛋白表达均与患者组织分化程度、TNM分期和有无淋巴结转移密切相关(P<0.05),但与患者性别和年龄无关(P>0.05)。第二章抑制SCD-1表达下调对食管鳞癌细胞增殖和细胞凋亡的影响及其分子机制探讨材料和方法：1.细胞培养和转染：将本室冻存的食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,当细胞融合度达80%～90%时,按照Lipofectamine TM2000操作说明将SCD-1siRNA和对照siRNA转染食管鳞癌细胞,转染48h后进行相关的实验。SCD-1siRNA组(转染SCD-1siRNA)为实验组；以未处理组(不进行任何处理)、脂质体组(转染时只加脂质体)、对照siRNA组(转染对照siRNA)为阴性对照组。2.Real-time PCR检测SCD-1mRNA表达：检测人食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞株SCD-1mRNA的表达,并检测SCD-1mRNA在不同浓度的SCD-1siRNA处理组、未处理组、脂质体处理组和对照siRNA组EC1细胞中的相对表达量。3.Western blotting:检测人食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞株SCD-1蛋白的表达,并检测SCD-1蛋白在不同浓度的SCD-1siRNA处理组、未处理组、脂质体处理组和对照siRNA组ECl细胞中的相对表达量；以及观察50nmol/L siRNA组与未处理组、脂质体处理组和对照siRNA组中与细胞凋亡有关的磷酸化Akt、bcl-2、bax蛋白表达以及总Akt蛋白表达水平差异。4.CCK-8法检测细胞增殖：分别收集50nmol/L SCD-1siRNA转染后24h、48h、72h及96h的4组食管鳞癌EC1细胞,加入含10%CCK-8的等量新鲜培养基于37℃培养3h,然后用酶标仪测450nm的吸光度。5.流式细胞术法检测细胞凋亡：收集50nmol/L SCD-1siRNA组、未处理组、脂质体处理组和对照siRNA组转染后48h的食管鳞癌EC1细胞,采用预冷PBS进行洗涤,按1×106/ml密度重悬细胞,然后取100u l细胞置于流式管中,加入Annexin V-FITC和碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)各5ul,避光孵育15min后流式细胞仪检测1×104个细胞,CellQuest分析其结果。6.统计学处理：应用SPSS17.0软件分析实验数据,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用x2检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05具有统计学意义。研究结果：1.Real-time PCR结果显示,SCD-1mRNA在食管鳞癌ECl、Eca109和EC9706细胞中的相对表达量均显著高于正常食管组织(NE)中SCD-1mRNA的表达(P<0.05),且SCD-1mRNA在EC1细胞中的表达明显高于Eca109和EC9706(P<0.05)。此外,与未处理的ECl细胞、单纯脂质体组和对照siRNA组相比,不同浓度的SCD-1siRNA均能显著下调食管鳞癌EC1细胞中SCD-1mRNA的表达(P<0.05),其中50nmol/L浓度干扰效果最佳(P>0.05)。2.Western blotting结果表明,SCD-1蛋白在食管鳞癌EC1、Eca109和EC9706细胞中的相对表达量均显著高于正常食管组织(NE).中SCD-1蛋白的表达(P<0.05),并且SCD-1蛋白在ECl细胞中的表达明显高于Eca109和EC9706(P<0.05)。此外,与未处理的EC1细胞、单纯脂质体组和对照siRNA组相比,不同浓度的SCD-1siRNA显著降低食管鳞癌ECl细胞中SCD-1蛋白的表达,其中50nmol/L浓度干扰效果最佳(P<0.05)。3.细胞增殖结果显示,未处理组、脂质体处理组和对照siRNA组之间在转染24、48、72和96h时食管鳞癌EC1细胞的增殖无差异(P>0.05),但是与未处理组、脂质体处理组和对照siRNA组相比,50nmol/L SCD-1siRNA组中ECl细胞增殖在转染后的各个时间点均受到显著抑制(P<0.05)。4.FCM法检测结果表明,未处理组、脂质体组和对照siRNA组之间EC1细胞的活细胞率均显著高于SCD-1siRNA组中EC1的活细胞率(F=129.162,P=0.000),而未处理组、脂质体组和对照siRNA组之间EC1细胞的活细胞率无差异(P>0.05)。此外,未处理组、脂质体组和对照siRNA组之间ECl细胞早期凋亡率均显著低于SCD-1siRNA组中ECl细胞早期凋亡率(25.35±0.68%)(F=275.428,P=0.000),而未处理组、脂质体组和对照siRNA组之间EC1细胞早期凋亡率无差异(P>0.05)。5.SCD-1表达抑制能显著下调pAkt和bcl-2蛋白表达,上调bax蛋白表达(P<0.05),但总的Akt表达水平在4组中无明显差异(P>0.05)。研究结论：SCD-1的高表达可能与食管鳞癌的发生发展密切相关,其表达下调介导的增殖抑制和细胞凋亡可能与Akt信号途经的失活及凋亡相关蛋白表达变化密切相关,因而,抑制SCD-1的表达有望成为食管鳞癌重要的分子治疗靶点。