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目的 针刺可以减轻内毒素急性肺损伤,但具体机制尚不明确。我们既往研究发现:在内毒素急性肺损伤时,血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达上调可以促进线粒体融合、抑制线粒体分裂,其内源性器官保护作用可能与影响线粒体融合/分裂相关;电针刺可以通过上调HO-1表达以减轻内毒素急性肺损伤。这些研究结果引起我们对针刺、HO-1与线粒体融合/分裂蛋白相关性的关注。鉴于此,本课题拟阐明电针刺对内毒素急性肺损伤(acute lung injury,ALI)肺组织线粒体融合/分裂运动的影响;探讨电针刺是否通过上调HO-1调控内毒素ALI肺组织线粒体融合/分裂的动态平衡改善线粒体功能以减轻肺损伤。方法 阐明电针刺对内毒素ALI肺组织线粒体融合/分裂运动的影响;探讨电针刺是否通过上调HO-1调控内毒素ALI肺组织线粒体融合/分裂的动态平衡改善线粒体功能以减轻肺损伤,本研究分为实验一和实验二。实验一:为探讨电针刺对内毒素ALI肺组织线粒体融合/分裂运动的影响,我们选取新西兰大白兔40只,采用随机数字表法分为4组即正常对照组(C组)、急性肺损伤组(M组)、非穴位电针刺激+急性肺损伤组(SEAM组)和穴位电针刺激+急性肺损伤组(EAM组)。M组、SEAM组、EAM组经耳缘静脉注射LPS 5 mg/kg制备内毒素急性肺损伤模型。静脉注射LPS前4、3、2、1 d和30 min,EAM组选取足三里和肺俞穴,SEAM组选取足三里和肺俞穴旁开1 cm非经非穴部位,建立电针刺模型。注射LPS 6 h后处死动物,光镜下观察病理学结果并计算肺损伤评分,检测W/D,电镜观察线粒体超微结构改变,检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量、呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR)及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)以了解线粒体功能状态,采用Real-Time PCR检测和Western blot法测定线粒体融合/分裂标记物表达来了解线粒体融合/分裂的变化情况。实验二:为探讨电针刺是否可以通过HO-1调节肺组织线粒体运动相关蛋白来调控其融合/分裂的动态变化,我们选取健康清洁级雄性新西兰大白兔70只,采用随机数字表法分为7组即正常对照组(C组)、LPS建立内毒素ALI模型组(LPS组)、非穴位电针刺+LPS建立内毒素ALI模型组(LPS+non-acupoint EA组)、电针刺激穴位+LPS建立内毒素ALI模型组(LPS+EA组)、电针刺激穴位+内毒素ALI模型+HO-1阻断剂组(LPS+EA+ZnPP组)、电针刺激穴位+内毒素ALI模型+HO-1诱导剂组(LPS+EA+hemin组)、电针刺激穴位+内毒素ALI模型+HO-1诱导剂+HO-1阻断剂组(LPS+EA+hemin+ZnPP组)。LPS组、LPS+non-acupoint EA组、LPS+EA组、LPS+EA+ZnPP组、LPS+EA+hemin组、LPS+EA+hemin+ZnPP组经耳缘静脉注射LPS 5 mg/kg制备内毒素急性肺损伤模型。LPS+EA组、LPS+EA+ZnPP组、LPS+EA+hemin组、LPS+EA+hemin+ZnPP组静脉注射LPS前4、3、2、1 d和30 min时选取足三里和肺俞穴进行电针刺激,建立电针刺模型。LPS+non-acupoint EA组给予非穴位电刺激。LPS+EA+hemin group组、LPS+EA+hemin+ZnPP组给予LPS前1h静脉注射100mg/kg HO-1诱导剂hemin,LPS+EA+ZnPP组、LPS+EA+hemin+ZnPP组给予LPS前1h静脉注射10μmol/kg HO-1抑制剂ZnPP。注射LPS 6 h后处死动物,光镜下观察病理学结果并计算肺损伤评分,检测W/D,电镜观察线粒体超微结构改变,检测ATP含量、ROS生成量、RCR及MMP以了解线粒体功能状态,采用Real-Time PCR检测和Western blot法测定线粒体融合/分裂标记物及HO-1的表达明确电针是否通过上调HO-1调控线粒体融合/分裂平衡的。结果通过实验一我们发现:与C组比较,M组、SEAM组和EAM组肺损伤评分、W/D及ROS含量均升高,ATP含量、MMP与RCR均降低,Mfn1、Mfn2和OPA1的mRNA和蛋白表达下调,Drp1 mRNA和蛋白表达上调(P均<0.05);与M组比较,EAM组肺组织肺损伤评分和W/D均降低(P<0.05),SEAM组肺损伤评分和W/D差异无显著统计学意义(P>0.05),SEAM组和EAM组肺组织ATP含量、MMP与RCR均升高,ROS生成降低,Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA和蛋白表达上调,Drp1 mRNA和蛋白表达下调(P均<0.05);与SEAM组比较,EAM组肺损伤评分、W/D和ROS含量均降低,ATP含量、MMP与RCR均升高,Mfn1、Mfn2和OPA1的mRNA和蛋白表达上调,Drp1 mRNA和蛋白表达下调(P均<0.05)。通过实验二我们发现:与C组比较,LPS组、LPS+non-acupoint EA组、LPS+EA组、LPS+EA+ZnPP组、LPS+EA+hemin组、LPS+EA+hemin+ZnPP组肺损伤评分、W/D和ROS的产生均升高,ATP含量、MMP和RCR均降低,Mfn1、Mfn2、OPA1mRNA和蛋白的表达显著降低,而Drp1和HO-1 mRNA和蛋白的表达水平升高(P均<0.05);与LPS组比较,LPS+EA组肺损伤评分和W/D均降低(P均<0.05),LPS+non-acupoint EA组肺损伤评分和W/D差异无显著统计学意义(P>0.05),LPS+non-acupoint EA组、LPS+EA组ATP含量、MMP和RCR均升高,ROS的产生减少,Mfn1、Mfn2、OPA1和HO-1 mRNA和蛋白的表达显著升高,而Drp1mRNA和蛋白的表达水平降低(P均<0.05);与LPS+non-acupoint EA组比较,LPS+EA组肺损伤评分、W/D、ROS的产生均减少,ATP含量、MMP和RCR均升高,Mfn1、Mfn2、OPA1、HO-1 mRNA和蛋白的表达显著升高,而Drp1mRNA和蛋白的表达水平降低(P均<0.05);与LPS+EA组比较,LPS+EA+hemin组肺损伤评分、W/D和ROS的产生均降低,ATP含量、MMP和RCR均升高,Mfn1、Mfn2、OPA1、HO-1mRNA和蛋白的表达显著升高,而Drp1mRNA和蛋白的表达水平降低(P均<0.05),LPS+EA+ZnPP组肺损伤评分、W/D、ROS的产生均升高,ATP含量、MMP和RCR均降低,Mfn1、Mfn2、OPA1、HO-1mRNA和蛋白的表达显著降低,而Drp1mRNA和蛋白的表达水平升高(P均<0.05);与LPS+EA+hemin组比较,LPS+EA+ZnPP组、LPS+EA+hemin+ZnPP组肺损伤评分、W/D和ROS的产生均升高,ATP含量、MMP和RCR均降低,Mfn1、Mfn2、OPA1、HO-1mRNA和蛋白的表达显著降低,而Drp1mRNA和蛋白的表达水平升高(P均<0.05);与LPS+EA+ZnPP组比较,LPS+EA+hemin+ZnPP组肺损伤评分、W/D和ROS的产生均减少,ATP含量、MMP和RCR均升高,Mfn1、Mfn2、OPA1和HO-1 mRNA和蛋白的表达显著升高,而Drp1mRNA和蛋白的表达水平降低(P均<0.05)。结论 1.电针刺可通过调节内毒素ALI时肺组织线粒体融合/分裂的动态平衡来改善线粒体功能,从而发挥肺保护作用;2.电针刺调控内毒素ALI肺组织线粒体融合/分裂的动态平衡,其机制与针刺上调HO-1有关。