乳腺癌是全球妇女中最常见、发病率上升最快、X线检查最多、活检量最多、社会支出最大的恶性肿瘤。据2011年2月4日美国癌症协会(American Cancer Society, ACS)对全球癌症统计学数据报告显示,乳腺癌是女性最常见的癌症(23%),乳腺癌相关死亡率也居女性癌症死亡率之首(14%)。近10年来,我国乳腺癌发病率以每年3%的速度递增,总体发病率较10年前增长了37%,死亡率增长了38.9%,发病年龄也比发达国家的发病年龄提前了15-20岁,是严重威胁我国女性健康的恶性肿瘤之一雌激素是一种重要的类固醇激素,通过雌激素受体(estrogen receptor, ER)的介导,参与调节作用于生殖系统和非生殖系统的多种生理功能,并与多种临床疾病相关,其中乳腺癌最受关注。生理状态的雌激素信号参与乳腺上皮细胞的增殖和分化,不规则的雌激素信号可刺激细胞增殖,因而增大乳腺癌风险。传统的雌激素受体-α(estrogen receptor-α, ER-α)蛋白由595个氨基酸组成,分子质量为66kDa,现称之为ER-a66。2005年,一种分子量为36kDa的ER-a新亚型被鉴定、克隆,因其分子质量为35.7kDa,而命名为ER--36。与ER-a66不同,ER-α36缺少ER-α66的两个转录活性域AF-1和AF-2,但保留了的DNA结合域和部分二聚化区域以及部分配体结合域,其配体结合域的C末端以独特的27个氨基酸残基序列取代ER-α66的最后138个氨基酸,介导着与ER-α66完全不同的雌激素信号通路,可对乳腺癌细胞产生更强的生长刺激作用。目前,ER-α36的作用机制已被鉴定为膜启动的类固醇信号传递(membrane-initiated steroid signaling, MISS),即非基因组作用模式。在这一作用模式下,ER-α36可以通过配体依赖或非配体依赖方式激活MAPK/ERK和PI3K/Akt通路。研究表明,ER-α36的表达水平与乳腺癌的进展、预后及TAM先天耐药性的产生有着密切联系。体外试验显示,在ER-α36高表达的MCF-7细胞中,TAM不但不能抑制细胞生长,反而可以刺激细胞的增殖。ER-α36和HER-2之间通过正反馈串话机制介导非基因组效应,促进乳腺癌细胞的生存,并导致对三苯氧胺(他莫昔芬,tamoxifen, TAM)的原发性耐药和获得性耐药,同时,该变异体的高表达还参与介导了TAM副作用所致的子宫内膜癌。由于ER-α36不但在乳腺癌、子宫内膜癌中可以表达,也常表达于胃癌、肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的组织细胞中,伴随着对ER-α36在疾病发生中的作用及机制的认识不断深入,已受到越来越多的研究机构(院所)和医疗机构的关注。特别是在对乳腺癌选择内分泌治疗方案时,有必要将ER-α36与ER-a66联合检测,以判断患者是否能从TAM治疗获益。通过ER-α36的表达水平,可为乳腺癌类型进一步分类,有助于对内分泌治疗的预后判断,也可进一步推广运用于雌激素相关疾病的预警、发生发展情况的监测和临床评价。但目前尚无商业化的ER-α36抗体,国内近几年围绕ER-a36蛋白所做的一些研究工作所用的ER-α36多抗,大多是国外的研究机构惠赠或是通过诱导表达ER-α36与标签蛋白的融合蛋白进行间接观察,国际、国内更是尚无针对ER-α36的检测试剂获得批准上市。这给鉴定ER-α36在细胞内的定位、表达及其在疾病诊断和选择治疗方案中的研究带来了很大的困难。同时,也需要一种便捷、快速、高效的ER-a36与ER-a66联合检测方法,而且,ER-α36对乳腺癌生物学特性的影响及作用机制也尚未得到较为全面的阐述。鉴于此,本研究旨在制备出纯度和活性较高、特异性较强的羊抗人ER-a36多克隆抗体,摸索出其在ER-α36的免疫组织(细胞)化学和蛋白印迹检测中的应用体系,为后续研究提供材料和免疫学检测方法,同时构建真核表达载体,将之转染入雌激素受体阳性的MCF-7细胞,使之获得稳定表达,以转染后的细胞为对象,探索从基因水平建立一种高效的ER-α36与ER-α66联合PCR检测方法,较为全面的探讨ER-α36对雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制,以及睾酮对ER-α36高表达ER-α66阳性乳腺癌细胞的作用。实验一抗ER-α36多克隆抗体的制备及其初步应用目的制备高纯度高效价的抗ER-α36多克隆抗体,建立蛋白印迹实验和免疫细胞化学检测方法,为后续研究提供可用的实验材料和方法。方法人工合成ER-α36蛋白C末端的特异性27肽和在N端加入GGGGSGGGGS连接臂后乙酰化修饰的37肽,利用碳化二亚胺法将此37肽分别与载体蛋白偶联为偶联蛋白ER-a36-OVA和ER-a36-BSA,用ER-a36-OVA免疫羊获得抗ER-α36的免疫血清,利用人工合成ER-α36蛋白C末端的特异性27肽制备免疫亲和层析柱,亲和纯化多抗,SDS-PAGE法、ELISA法和蛋白印迹法对抗体进行纯度、效价及特异性进行分析与鉴定,并将获得的多抗在免疫细胞化学检测中进行初步应用。结果ER-α36的37肽和OVA、BSA偶联比分别为7.2：1和8.9：1；经四次免疫山羊后,用ERa36-BSA检测羊抗血清经16倍稀释仍可见清晰的免疫沉淀线：ELISA检测显示所制备多抗效价达到104以上,与北京坤基奥医药科技有限公司提供的ER-α46和ER-α66无交叉反应；免疫组织(细胞)化学的结果显示ER-α36蛋白主要表达在细胞膜和/或细胞质,蛋白印迹检测结果显示分子量约为36kDa。结论所制备的抗ER-a36多克隆抗体纯度高、效价高、特异性强,可用于ER-a36的蛋白印迹实验和免疫组化检测,为进一步研究ER-a36的功能和应用提供了工具和技术手段。实验二ER-a36过表达乳腺癌细胞的建立及其对雌二醇和三苯氧胺的敏感性目的构建ER-α36基因的真核表达载体,并在MCF-7细胞内进行表达和鉴定,观察ER-α36过表达时,MCF-7细胞对雌二醇和三苯氧胺的敏感性。方法从已知ER-a36强表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中提取总RNA,以此为模板,经过RT-PCR扩增得到ER-a36全基因序列,回收扩增片段,经EcoR I、Not I分别将扩增产物及pcDNA3.1载体双酶切片段获得线性DNA片段,用T4DNA连接酶将二者连接并转化到DH5α感受态细胞中,对转化子进行酶切电泳、基因测序法对阳性克隆进行鉴定,将鉴定正确的阳性克隆扩大培养,提取重组DNA载体,并用脂质体法转染MCF-7细胞,筛选出具有G418抗性的单细胞克隆进行扩大培养。通过荧光定量PCR和Western blot检测ER-a36和ER-α66蛋白在MCF-7细胞中的表达情况。并以野生型MCF-7细胞用为对照,用台盼蓝拒染试验观测10-10～10-6mol/L E2对转染后细胞生长刺激作用的变化,以及10-10～10-6mol/L三苯氧胺(TAM)转染后细胞抑制率的变化。结果成功构建了ER-α36基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-ERα36:重组真核载体转染MCF-7细胞后,经G418筛选,建立了ER-α36基因和蛋白获得了稳定高表达的MCF-7/ER-α36细胞。与野生型的MCF-7细胞相比,在10-10～10-6mol/L的E2浓度区间内,在同一E2浓度下,MCF-7/ER-α36细胞的增殖增加率均显著高于MCF-7/W组(P<0.05)。对MCF-7/ER-α36细胞组,10-10～10-8mol/L的TAM作用下,细胞并未显示出生长抑制,而10-7～10.6mol/L TAM组的细胞生长抑制率仅为(4.00±0.51)%和(7.56±1.11)%,均与同浓度的MCF-7/W具有显著性差异(P<0.05)。结论本实验成功构建了ER-α36基因的真核表达载体,转染MCF-7细胞后获得高表达,ER-α36过表达提高了ER(ER-α66)阳性细胞MCF-7对E2的敏感度,TAM对其生长抑制作用显著降低或促进细胞生长增殖,ER-α36过表达可能是ER (ER-α66)阳性细胞对TAM原发性耐药的始动力。实验三ER-α36过表达对MCF-7细胞生物学行为的影响目的探讨雌激素受体新亚型ER-α36对人雌激素受体阳性乳腺癌细胞生长、增殖、凋亡、体外成瘤能力及侵袭转移潜力等恶性生物学行为的影响及其机制,并观察睾酮对其作用的影响。方法以野生型细胞系MCF-7/W、转染pcDNA3.1空载体的细胞系MCF-7/pcDNA3.1和转染重组载体pcDNA3.1/ER-αc36的MCF-7/ER-α36细胞系为研究对象,分别用MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡指数、集落形成试验检测细胞的体外成瘤能力、细胞粘附试验观测肿瘤细胞与细胞外基质的粘附能力、Transwell侵袭小室试验检测细胞侵袭转移能力,并用Western blot法检测三种细胞中NF-κB p65、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达量,并计算MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值的变化。对MCF-7/ER-α36细胞给予10-8mol/L睾酮干预,观察睾酮作用对细胞上述恶性行为及相关蛋白表达量的影响。结果MCF-7/W与MCF-7/pcDNA3.1两种细胞恶性行为学特性没有明显差别,而与与MCF-7/W组细胞相比,MCF-7/ER-a36细胞的生长曲线较陡直,细胞提前1天进入平台期,G0/G1期细胞的比例减少了12.33%,而S期细胞的比例增加了39.96%,细胞凋亡率减少了56.84%,其2周末集落形成率、2h细胞粘附率和24h穿膜细胞数分别增加了50.37%、42.31%和70.83%,上述变化均具有显著性差异(P<0.05)。而在MCF-7/ER-a36组细胞加入10-8mmol/L睾酮作用后,上述变化趋势进一步加剧,并在两者之间也具有显著性差异(P<0.05)。Western blot检测结果显示,除TIMP-1蛋白表达量没有显著升高外,MCF-7/ER36组细胞中NF-Kp65、MMP-2、MMP-9和’TIMP-1蛋白的相对表达量及MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1分别是MCF-7/W组的1.91倍、1.68倍、1.70倍、1.60倍和1.62倍、1.30倍,均具有统计学意义(P<0.05)；而在MCF-7/ER-a36组细胞加入10-8mmol/L睾酮作用后,上述变化趋势进一步加剧,并在两者之间也显示出显著性差异(P<0.05)；加入NF-κB p65抑制剂PDTC的情况下,各项指标均向野生型MCF-7/W细胞水平回归,分别比不加PDTC时降低了20%-80%不等,但MMP-2和MMP-9蛋白表达量仍具有显著性差异(P<0.05)。结论(1)ER-a36是ER-a66阳性乳腺癌细胞向高恶性程度分化的分子标志物,能促进ER-a66阳性乳腺癌细胞的生长增殖能力、体外成瘤能力和侵袭转移潜力,并加快其细胞周期进程和降低细胞凋亡,其机制与通过NF-κB途径提高MMP-2、MMP-9的转录表达水平及打破二者与TIMP-1之间的平衡有关；(2)睾酮可通过NF-κB途径促进ER-a36高表达乳腺癌细胞恶性行为特征的表现,对于这一分子亚型的乳腺癌患者,不大可能从睾酮治疗获益；NF-κB有可能成为雌激素受体阳性而ER-α36高表达乳腺癌治疗的靶向分子之一。