结球甘蓝高密度遗传连锁图谱的构建与主要农艺性状的QTL定位

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结球甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata),别名圆白菜、卷心菜、包菜等,属十字花科(Brassiceae)芸薹属(Brassica)的一年生或二年生草本植物。结球甘蓝具有品质好、适应性强、产量高、耐储运等特点,已成为国内外普遍栽培的一种重要蔬菜作物,在我国蔬菜的周年供应中起到重要作用。本研究基于结球甘蓝全基因组测序项目,利用全基因组de novo和重测序数据开发出SSR、SNP和InDel标记;利用不同生态型的结球甘蓝高代纯合自交系01-88和02-12杂交获得F1,通过游离小孢子培养获得DH群体,利用该DH群体构建甘蓝高密度遗传连锁图谱,该图谱作为参考图谱服务于基因组的组装,同时为功能基因克隆及基因组比较研究提供技术支持,并在探寻十字花科芸薹属作物的起源,特别是在通过比较图谱阐述基因组组成和进化关系中起到重要作用;针对未锚定到基因组且片段较大的Scaffolds设计InDel标记,并将其补充组装到甘蓝基因组上,进一步充实甘蓝基因组信息;通过对甘蓝主要农艺性状进行遗传和相关性分析以及基因定位,结合转录组测序信息对控制相关性状的基因进行预测,获得更多重要农艺性状完整的遗传信息,为结球甘蓝分子标记辅助育种及相关基因的克隆打下理论基础;筛选与甘蓝显性雄性核不育基因紧密连锁的分子标记,建立一种高效甘蓝显性雄性不育基因的鉴定方法;本研究对提高结球甘蓝的育种水平,提高选择效率具有重要的理论意义和实用价值。本研究获得的主要成果如下:(1)选用不同生态型的结球甘蓝高代纯合自交系01-88与02-12杂交获得F1,通过游离小孢子培养技术构建了含有189个基因型的DH群体。(2)甘蓝基因组中共检测到233844个SSR位点,共包含6种类型的重复单元,其中单核苷酸重复单元MNRs(163621,69.97%)数目最多,最少为六核苷酸重复单元HNRs(311,0.13%)。利用这些位点信息通过Primer3.0软件共设计并合成SSR引物3378对;通过比对de novo测序及重测序数据,共检测到SNP位点1026766个,针对含有单碱基变异位点的序列,应用SNAPER软件共设计并合成SNP引物2200对。(3)利用双亲01-88和02-12对8479对引物进行筛选,最终筛选出有多态性的引物1274对,多态性比例为14.99%;将有多态性的引物用于DH群体检验,利用Joinmap4.0软件构建一张包含1227对分子标记(602SSRs;625SNPs)、覆盖基因组总长度为1197.9cM,平均遗传距离和物理距离分别为0.98cM和503.3Kb的结球甘蓝高密度遗传连锁图谱。该图谱是目前最饱和的甘蓝类作物参考遗传图谱。(4)针对71个未锚定到基因组上,且长度大于200kb的Scaffolds设计了172对InDel标记,通过双亲筛选有84对InDel标记具有多态性。利用该84对多态性标记补充锚定了43个Scaffolds,物理长度总计为22.6Mb。结合补充锚定的Scaffolds,目前甘蓝全基因组组装已达到562.6Mb,组装比率从原来的85.0%上升到89.3%。(5)采用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型对5个与甘蓝叶球相关(叶球重、叶球纵径、中心柱长、叶球颜色、外短缩茎长)和6个与植株相关(外叶数、开展度、株高、外叶长、外叶宽、外叶颜色)的农艺性状进行遗传和相关性分析。DH群体分析结果表明,11个主要农艺性状均为数量性状,除外叶宽和外叶颜色性状为多基因控制外,其余9个农艺性状均由2对主基因+多基因控制。主基因遗传率范围为19.56%(开展度)~79.45%(叶球重)。(6)应用IBM SPSS Statistics19软件偏相关分析的Pearson方法,对甘蓝11个主要农艺性状相关性进行分析。结果表明叶球颜色与外叶颜色,叶球纵径与中心柱长等成对性状呈显著正相关;叶球重与外短缩茎长,叶球纵径与外叶数等成对性状呈显著负相关;叶球纵径与外叶长,外短缩茎长与开展度等成对性状呈不显著相关。(7)应用MapQTL4.0软件,采用IM和MQM作图法,根据甘蓝高密度遗传连锁图谱和DH群体农艺性状表型数据,共定位了控制甘蓝11个主要农艺性状的39个QTLs。其中,叶球纵径、外短缩茎长、外叶数和开展度性状定位的QTL数量最多为5个;中心柱长、叶球颜色和外叶宽性状定位的QTL数量最少为2个。定位的39个QTLs在9条连锁群上均有分布,其中有些QTLs呈现重合和连锁分布。(8)采用BSA方法,从含有425个单株的育性分离群体中随机挑选20株可育株和不育株的DNA组建2对可育池和不育池。利用分子标记技术,在2对育性池中共筛选得到3对与不育基因CDMs399-3连锁的SSR分子标记。其中最近的双侧翼标记为scaffold38115和scaffold13994的遗传距离分别为8.3和15.3cM。(9)通过对构建甘蓝DH群体的双亲进行转录组分析,将得到的差异表达基因与主要农艺性状的QTLs相比较分析,共筛选得到控制8个主要农艺性状的10个候选基因,其中有8个候选基因与生长素和细胞分裂素合成、代谢和运输相关,2个候选基因与叶绿素和类胡萝卜素合成、代谢相关。
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