基于G-四链体-Hemin DNA酶的核酸传感器和Cu2+传感器的设计

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G-四链体-Hemin DNA酶是由特定的核酸-G-四链体与氯化血红素(Hemin)结合后形成的具有过氧化物酶活性的一类人工模拟酶。该酶能够有效地催化H2O2参与的一些反应,如催化H2O2氧化ABTS(2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))的反应,产生具有特征绿色的阳离子自由基(ABTS·+)。目前这类DNA酶已被广泛地用在了多种化学传感器和生物传感器的设计中(包括金属离子传感器、适配体传感器、酶传感器、DNA传感器及药物传感器)。   本文结合G-四链体-Hemin DNA酶的特点设计了两种传感器,一种是核酸传感器,它采用等温扩增的方法来形成G-四链体-Hemin DNA酶,有效地对核酸进行特异性检测。另一种是Cu2+传感器,它是基于特异性的Cu2+裂解酶参与形成的G-四链体-Hemin DNA酶,设计出一种高灵敏度、高选择性的Cu2+检测方法。DNA传感器中使用的寡核苷酸探针链主要由两部分组成:一部分是5-端的富G序列;另一部分是3-端的引物序列。5-端的富G序列由于只含有三组连续的GGG序列,无法满足G-四链体的形成条件,从而不能形成G-四链体(G-四链体的形成至少需要四组GGG序列),在Hemin的存在下催化能力也很弱。而当靶基因存在时,在一个合适的温度下,3-端的引物序列会特异性地与靶基因结合,并在Taq DNA聚合酶的帮助下沿靶基因链延伸。由于引物结合位点下游的靶链上存在有连续的碱基Cn(n≥2)序列,引物会沿靶链延伸出相应数目的连续Gn(n≥2)序列。延伸后的探针链具有4个Gn重复序列,可以形成G-四链体,在Hemin的存在下显示酶活性,能够催化H2O2与ABTS的反应。其检测结果可用裸眼判断。在选定的合适温度下,探针与靶基因之间的特异性结合与解离是动态的过程,因此延伸后的引物序列能从靶基因上解脱下来,其它未延伸的引物序列就能再次结合在靶基因上并得以延伸。并且由于一条靶基因链可以参与多条寡核苷酸探针链的延伸,因此在一定程度上实现了G-四链体的富集作用,从而提高核酸检测的灵敏度,检测限可达到0.27 nM。在Cu2+传感器的设计中,使用了两条无标记的寡核苷酸链,在没有Cu2+存在时,两条寡核苷酸链可以以一种三链体和发夹结构存在,富G序列被包埋在发夹结构当中因而无法形成G-四链体,加入Hemin后,体系无催化活性。而加入Cu2+后,寡核苷酸链就会在特定的位点处被切断,分子内的发夹结构则转化为分子间的二倍体结构。伴随着寡核苷酸链稳定性的显著下降,富G序列被释放出来,进而形成稳定的G-链体结构,G-四链体与Hemin结合后能够有效的催化H2O2氧化ABTS的反应,反应体系中产生的ABTS·+离子在422 nm处显示有最大吸收。因此可以用422 nm处光度值的变化来检测Cu2+。并且由于一个Cu2+可以参与多个寡核苷酸链的裂解,可在一定程度上实现G-四链体的富集作用,伴随着检测体系酶活性的升高,进而可以能够实现Cu2+的高灵敏度检测。这种“turn-on”检测方式(信号随Cu2+浓度的增大而增强)检测Cu2+的线性范围为8~200 nM,检测限可达到4.5 nM。
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