研究背景:心房颤动(房颤)作为常见的心律失常之一,影响着3%的成年人。房颤及其并发症的出现影响着众多患者的生活质量。虽然房颤的治疗取得了一定的进展,但是仍然存在复发率高等问题,其原因是对发生机制认识没有完全明确。近年来众多的研究指出房颤的发生和维持与心房重构密切相关。心房重构早期主要是电生理重构,中后期的主要表现则是结构重构。心房的结构重构是房颤维持和复发的重要原因。在房颤发生时,心房肌细胞会发生凋亡,其发生与心房受到拉伸、缺氧、炎症和氧化应激等因素刺激有关。心房肌细胞凋亡后细胞数量的缺失造成心肌组织的构成改变,细胞缺失后成纤维细胞激活修复心肌组织,增加细胞外基质蛋白的分泌,从而组织间质纤维化,心房发生重构。心肌细胞规律的的收缩和舒张功能依赖于细胞内钙离子在肌浆网和胞浆之间的循环。胞浆中的钙离子在舒张期是由肌浆网钙泵(SERCA2a)泵回肌浆网,在收缩期由兰尼碱受体2型通道(RYR2)释放到胞浆中参与心肌收缩。受磷蛋白(PLB)是一种含有52个氨基酸的肽链,它有磷酸化五聚体和去磷酸化单体两种状态,单体PLB可以与SERCA2a结合使其活性减弱,是SERCA2a的负调节因子,磷酸化后的五聚体PLB失去对SERCA2a的抑制作用。PLB及其磷酸化水平的变化通过改变SERCA2a的活性影响细胞内钙离子的正常活动。钙离子活动异常和钙超载可以导致心房肌细胞凋亡参与心房重构,因此PLB及其磷酸化水平的变化可能在房颤的发生和维持中起重要的作用。本研究第一部分通过回顾两组风湿性瓣膜病患者的临床资料,总结房颤患者的发病特点,检测并对比两组患者心房组织的纤维化水平、心房肌细胞凋亡及凋亡基因的表达情况,探讨心房肌细胞凋亡在房颤心房重构中的意义;第二部分通过检测两组患者心房组织中CaMKⅡ和PLB的基因表达水平以及PLB、PLBp17、CaMKⅡp286的蛋白水平,在HL-1细胞系使用siRNA沉默PLB的mRNA后,观察细胞的凋亡情况,探讨PLB及其磷酸化水平的变化参与房颤心房重构的作用机制。研究方法:第一部分心房肌细胞凋亡及凋亡相关基因在房颤心房重构中的意义1.临床资料:2016年9月至2017年10月接受二尖瓣置换手术的风湿性心脏病患者695例,根据动态心电图及病史资料分为两组,窦律组212例,房颤组483例。2.组织标本采集:术中体外循环建立后心脏停跳前获取右心房组织,除去脂肪组织,用生理盐水洗净血液,分为三部分,第一部分用于制作快速冰冻切片,第二部分用于制作石蜡切片,第三部分用于提取组织总RNA。根据动态心电图及病史资料分组,窦律组(10例)和房颤组(15例)心房组织标本均按照此方法获取、保存。3.运用Masson染色和天狼猩红染色检测并比较两组组织纤维化水平。4.运用免疫荧光检测并比较两组心房肌细胞凋亡比率。5.运用RT-qPCR检测并比较两组心房组织凋亡相关基因mRNA水平。第二部分PLB及其磷酸化水平变化参与诱导心房肌细胞凋亡1.组织标本采集:术中体外循环建立后心脏停跳前获取右心房组织,除去脂肪组织,用生理盐水洗净血液,分为两部分,第一部分用于提取组织总RNA,第二部分用于提取组织总蛋白。根据动态心电图及病史资料分组,窦律组(11例)和房颤组(19例)心房组织标本均按照此方法获取、保存。2.运用RT-qPCR检测并比较两组心房组织CaMKⅡ和PLB mRNA水平。3.运用Western Blot检测两组PLB、PLBp17、CaMKⅡp286的蛋白表达水平。4.通过siRNA沉默HL-1细胞株PLB的mRNA,干扰后培养48h运用流式细胞仪检测细胞凋亡比率。研究结果:第一部分心房肌细胞凋亡及凋亡相关基因在房颤心房重构中的意义1.临床资料显示,与窦律组比较,房颤组患者的年龄大(P<0.01)、住院时间长(P<0.05)、合并肺动脉高压的患病率显著增高(P<0.01),并发左房血栓和脑梗的发生率显著增大(分别P<0.01,P<0.05))、心功能分级Ⅱ级显著减少,而Ⅲ和Ⅳ显著增加(均P<0.01),LADd、RADd和RVDd较大(均P<0.01),EF显著降低(P<0.01)、三尖瓣反流增大(P<0.01)。2.组织标本基线资料:与窦律组比较,房颤组患者的LADd、RADd显著增大(P<0.01),EF则显著降低(P<0.01)。3.Masson染色和Sirius red染色的结果提示房颤组发生纤维化的程度明显高于窦律组(P<0.01),并且纤维化发生时胶原纤维以Ⅰ型和Ⅲ型为主。4.TUNEL染色后在荧光显微镜下观察,计算凋亡细胞率,统计结果显示房颤组凋亡率明显高于窦律组(P<0.01)。5.房颤组TP53,BAX,SNAI2基因mRNA表达显著高于窦律组,BCL2,BMP4则低于窦律组(均P<0.05)。第二部分PLB及其磷酸化水平变化参与诱导心房肌细胞凋亡1.组织标本基线资料:与窦律组比较,房颤组患者的LADd(P<0.05)、RADd P<0.01)显著增大,EF则显著降低(P<0.05)。2.RT-qPCR结果显示,与窦律组比较,房颤组心房肌组织中CaMKⅡ(P<0.05)基因和PLB基因(P<0.05)表达水平增加。3.Western Blot结果显示:与窦律组相比,房颤组CaMKⅡp286(P<0.05)和PLBp17(P<0.05)蛋白水平增加,房颤组PLB蛋白水平减少(P<0.05)。4.运用siRNA沉默PLB基因的表达后培养48h流式细胞仪凋亡检测显示,实验组凋亡比率相对于阴性对照组和空白组明显增加(P<0.05)。结论:1.房颤时出现了以心肌纤维化为主的心房重构组织学表现为心房肌纤维化增强,胶原容积分数增加,形态学表现为各个心腔的扩大,三尖瓣反流的增加。2.房颤的心房重构与心房肌细胞的凋亡相关房颤组心房肌细胞核凋亡比率增加,凋亡相关基因表达紊乱,房颤组心房组织中TP53,BAX,SNAI2三个基因表达增加,而BCL2,BMP4两个基因表达降低。3.PLB通过调控心房肌细胞凋亡参与心房重构房颤组心房组织中CaMKⅡ和PLB的基因上调,CaMKⅡp286和PLB p17的蛋白水平增加、单体PLB水平下降,使用siRNA沉默HL-1细胞PLB基因的表达,检测其细胞凋亡水平增加。提示PLB通过调控心房肌细胞凋亡在心房重构中发挥重要作用。