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表没食子儿茶素没食子酸酯(Epi-gallocatechin-3-gallate,EGCG),是茶多酚中主要的生物活性成分,具有抗氧化、抗炎、抑菌、清除体内自由基、降血脂、降血压和降血糖、预防心脑血管疾病等作用。高脂血症是目前宠物犬常见的营养代谢性疾病之一,给犬的健康带来巨大的威胁。本试验通过体外培养犬肝细胞,添加不同浓度的EGCG作用于犬肝细胞后,研究EGCG对AMPKα信号转导通路中相关蛋白和基因表达的影响,初步阐明EGCG降低犬肝细胞脂合成,增加脂氧化的作用机制。选取健康幼犬,通过两步灌流法分离培养犬原代肝细胞,添加不同浓度的EGCG(0、0.01、0.1和1.0μM EGCG),作用不同时间后,确定EGCG最佳添加浓度和作用时间。犬原代肝细胞培养48 h后,添加不同浓度的EGCG和AMPKα的抑制剂BML-275(0、0.01、0.1及1.0μM EGCG、10μM BML-275、0.1μM EGCG+10μM BML-275)作用于犬肝细胞。运用倒置显微镜和透射电镜观察犬肝细胞的形态学变化;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PPARα、SREBP-1c、ACO、CPTI、FAS、ApoE、ApoA1及ACCα基因表达量;采用蛋白质免疫印迹法(WB)检测AMPKα、p-AMPKα、PPARα、SREBP-1c、ACO、CPTI、FAS、ApoE、ApoA1、ACCα及p-ACCα蛋白的表达水平;采用细胞免疫荧光法检测PPARα和SREBP-1c核质分布情况;采用凝胶迁移滞后实验(EMSA)法检测EGCG对PPARα和SREBP-1c转录活性的影响;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测AMPKα、ACCα和CPTI的酶活性,测定AMP和ATP的含量;全自动生化分析仪检测犬肝细胞TG和VLDL的含量。结果显示:1.细胞形态学变化、细胞活性及细胞膜完整性变化:4 h后肝细胞贴壁生长,细胞边缘呈圆球形或者多边形,细胞贴附于细胞板上;培养48 h后,细胞贴壁牢固,长出伪足,呈多边形,胞浆内容物丰富,细胞排列紧密,细胞间间隙明显,细胞生长状态良好;0-48 h之间的LDH的漏出率逐渐下降,48 h以后上升至稳定状态,培养至48 h的LDH漏出率最低,说明此时肝细胞膜的完整性好,肝细胞的生长状态最好。选定48 h为肝细胞开始添加刺激因子最佳时间。2.EGCG最佳添加浓度和作用时间为0.1μM,30 min。添加相同浓度0.1μM的EGCG处理后,作用10 min组、30 min组与对照组相比p-AMPKα蛋白表达量差异极显著升高(P<0.01),且在处理30 min时AMPKα的磷酸化水平最高。3.AMPKα信号通路相关mRNA表达水平:与对照组相比,PPARα、ACO和CPTI的mRNA相对表达量随着EGCG的浓度增加而升高(P<0.01),BML-275抑制剂组显著降低(P<0.05或P<0.01),且与0.1μM的EGCG高浓度处理组相比,EGCG和BML-275混合组极显著降低(P<0.01);与对照组相比,SREBP-1c、FAS、ApoE、ApoA1、ACCα的mRNA相对表达量随着EGCG的浓度增加而降低(P<0.01),BML-275抑制剂组显著升高(P<0.05或P<0.01),且与0.1μM EGCG浓度处理组相比,EGCG和BML-275混合组极显著升高(P<0.01)。4.AMPKα信号通路相关蛋白表达水平:与对照组相比,p-ACCα、p-AMPKα、PPARα、ACO和CPTI的蛋白表达量随着EGCG的浓度增加而升高(P<0.05或P<0.01),BML-275抑制剂组显著降低(P<0.05或P<0.01),且与0.1μM的EGCG处理组相比,EGCG和BML-275混合组极显著降低(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,SREBP-1c、FAS、ApoE、ApoA1和ACCα的蛋白表达量随着EGCG的浓度增加而降低(P<0.05或P<0.01),BML-275抑制剂组显著升高(P<0.05或P<0.01),且与0.1μM的EGCG高浓度处理组相比,EGCG和BML-275混合组极显著升高(P<0.05或P<0.01)。5.采用激光共聚焦显微镜观察PPARα、SREBP-1c的免疫荧光结果:与对照组相比,EGCG的浓度处理组的PPARα的入核表达量明显升高,BML-275抑制剂组和EGCG和BML-275混合组入核表达量明显降低;与对照组相比,EGCG处理组SREBP-1c的入核表达量也明显,BML-275抑制剂组和EGCG和BML-275混合组的转录活性和入核表达量均显著升高。6.EMSA结果显示:与对照组相比,PPARα的转录活性随着EGCG的浓度增加而升高(P<0.05或P<0.01),BML-275抑制剂组显著降低(P<0.05);与对照组相比,SREBP-1c的转录活性随着EGCG的浓度增加而降低(P<0.05或P<0.01),BML-275抑制剂组极显著升高(P<0.01),且与0.1μM的EGCG高浓度处理组相比,EGCG和BML-275混合组极显著升高(P<0.01)。7.与对照组相比,AMPKα和CPTI酶活性随着EGCG的浓度增加而升高(P<0.01),BML-275抑制剂组显著降低(P<0.01),且与0.1μM的EGCG高浓度处理组相比(P<0.05或P<0.01),EGCG和BML-275混合组极显著降低(P<0.01);ACCα的酶活性随着EGCG的浓度增加而降低(P<0.01),BML-275抑制剂组显著升高(P<0.01),且与0.1μM的EGCG高浓度处理组相比(P<0.05或P<0.01),EGCG和BML-275混合组极显著升高(P<0.01)。8.与对照组相比,TG和VLDL的含量随着EGCG的浓度增加而降低(P<0.05或P<0.01)。综上所述,EGCG可以激活犬肝细胞AMPK信号通路,促进脂氧化,减少脂合成,从而犬肝细胞内的TG和VLDL的含量降低,减少肝脂的蓄积,明确EGCG调节犬肝细胞脂代谢的作用机制,为研制可用于犬的降脂产品奠定理论和实验基础。