论文部分内容阅读
前言 目前认为血管成形术后再狭窄是损伤的血管内膜增殖和血管重构的总和。细胞外基质在这个过程中所起的作用日益为人们所重视。细胞外基质受基质金属蛋白酶(MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的调控，在二者的动态平衡中维持血管的正常功能。细胞内信息传递和转录的调控也与再狭窄发生发展密切相关。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内多种促细胞增殖信息传递的交会点和共同通路，是细胞表型变化和增殖的关键酶，MAPK可编码两种细胞外信息调节酶P44ERK1和P42ERK2，他们活化后可以激活多种早期反应的核内癌基因，引起细胞增殖。有关再狭窄的研究进行了很多，药物防治再狭窄成功的关键是弄清再狭窄的发生机制，再有针对性地使用药物。 通心络由以岭药业集团研制，目前广泛应用于临床冠心病的治疗，基础研究证明通心络有抑制内皮损伤后血管内膜增殖的作用。本实验研究通过制作家兔动脉粥样硬化和血管成形术模型，使用中药通心络进行干预治疗，旨在证实通心络抑制内膜增殖和血管重构的可能途径和机制。 实验方法 一、动物模型的建立 1．实验动物：日本纯种雄性大耳白兔60只，体重2.5±0.5Kg，月龄6-8个月。中国医科大学实验动物部提供。 2．动脉粥样硬化模型建立：家兔适应性饲养1周，随机抽签分组：单纯拉伤组20只，高脂拉伤组20只，通心络治疗组20只。单纯拉伤组只喂专用颗粒饲料200g／d；高脂拉伤组和通心络治疗组喂专用颗粒饲料加胆固醇，专用饲料150g／d，胆固醇1.5g／d／kg体重。喂养四周。四周后行腹主动脉内皮剥脱术，术后喂养同前，再四周。 3．动脉血管成形术模型的建立： 腹主动脉内皮剥脱术后4周，动物在X光下先行腹主动脉造影，然后对造影显示狭窄超过30%的部位进行球囊扩张，再次造影，狭窄消失为扩张成功，共成功建立家兔血管成形术模型45只。 4.分组用药情况 血管成形术前三天，通心络组开始加用通心络(0.5扩亩kg体重)，同时各组均停用胆固醇。 二、标本采集及指标检测 1、血标本: 在高胆固醇喂养前(O周)、腹主动脉拉伤术前(4周)、PrCA术前(8周)及处死前(12周)，4次从耳缘静脉采血，分离上清置于一70℃保存备用。用于测血脂;内皮素(ET)，过氧化物歧化酶(SOD)，一氧化氮(NO)，组织型纤溶酶原激活剂(TPA)和纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)。 2、病理学检查 动物处死后根据X光照片取PrCA部位血管标本3 .5一4 .ocm，截为三段，分别用于用于光镜和免疫组化检测;电镜检测;分子生物学检测。 (1)HE及弹力纤维染色染好的切片分组进行计算机图象分析，分别测出管腔面积、内弹力板包绕面积、外弹力板包绕面积;再计算出内膜面积=内弹力板围绕面积一管腔面积，中膜面积=外弹力板围绕面积一内弹力板围绕面积。 (2)免疫组化分析:包括pCNA、MMPZ、MMPg、皿MP一、皿MPZ、ERK一及ERKZ，染色后利用计算机图象分析系统测算阳性细胞的光密度值和阳性细胞面积。 3、逆转录pCR(RT一pCR)测定MMPZ、MMPg、nMPI、TIMPZ的mRNA表达 采用异硫氰酸肌法提取血管标本中的总RNA，用Bca一Best RNA PcRKit逆转录试剂盒逆转录合成TIMpl、TIMPZ、MMPZ、MM即(温度52.2℃)、GAPDH(60℃)的cDNA产物。再进行cDNA扩增，扩增产物在2%琼脂糖上电泳，以GAPDH作为内参照，图象扫描仪测定电泳条带的光密度值，计算目的DNA的相对量。公式为:目的DNA的相对量二目的DNA条带的光密度值/GAPDH条带的光密度值x roo。 4、免疫印记(Western Blot)检测，测定ERKI及ERKZ的表达量 提取标本中的胞浆蛋白采用考马斯亮蓝法测定目的蛋白浓度，约为250林扩而。电泳、转膜、封闭，加1:500稀释的ERKI及ERKZ一抗4℃过夜。加1:500稀释的二抗，37℃两小时。显色巧分，出现粉红色条带，流水终止反应。扫描计算ERKI、ERKZ的相对量。实验结果 一、各组血脂水平变化结果 血清TG、TC、LDL一C水平显示:单纯拉伤组4次血无明显差别;高脂拉伤组和通心络组4周、8周的TG、TC、LDL一C水平高于单纯拉伤组(P<0.05)，但二者之间无差异(P>0.05);12周时，通心络组的TG水平与高脂拉伤组相比无明显差异(P>0.05)，但血清TC和LDL一C水平在通心络组明显低于高脂拉伤组(P之0.05)。血清HDL一C水平在各组之间的各个时间无明显差异。 二、各组内皮素(ET)和一氧化氮(NO)水平变化结果 血浆ET水平显示:高脂拉伤组和通心络组在4周和8周时ET水平高于单纯拉伤组(P<0.05);至12周时通心络组ET水平低于高脂拉伤组(P>0.05)。而血清NO水平则相反，4周和8周时NO水平低于单纯拉伤组(P>0.05);12周时NO水平通心络组高于高脂拉伤组(P<0.05)。 三、各组过氧化物歧化酶(SOD)水平变化结果 血浆SOD水平显示:高脂拉伤组和通心络组4周和8周时SOD水平低于单纯拉伤组(P<0 .05);12周时通心络组SOD水平高于高脂拉伤组(P<0 .05)。 四、各组组织型纤溶酶原激活剂(TPA)和纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)水平变化结果 血浆，rPA水平