论文部分内容阅读
姬松茸(Agaricus Blazei Murill)为珍稀药食兼用真菌,抗肿瘤活性居抗肿瘤活性真菌前列,具有很高的开发应用前景。本文从姬松茸子实体中提取了水溶性多糖,并对多糖进行了分离纯化,然后对多糖级分进行了理化性质、结构特征和免疫活性研究。采用热水提取、乙醇沉淀的方法提取姬松茸子实体多糖,并用苯酚硫酸法测得多糖提取率和粗多糖得率。热水回流提取的条件为:温度100℃,料液比1:20,提取时间4 h。多糖提取率为8.17%,粗多糖得率为12.2%。此法操作简单方便,不会引起多糖降解,多糖提取率较高。对比了5种树脂和Sevag法脱蛋白、脱色的效果,结果发现树脂法优于Sevag法。大孔吸附树脂D101、HPD-100和LX-22,离子树脂D113和D315 5种树脂的脱蛋白和脱色效果实验中,多糖保留率、蛋白脱除率和脱色率较高为D101和D315树脂。本论文采用不对电荷性质和大小有选择性的树脂D101。D101静态吸附的条件为:温度40℃,时间7 h。此条件下多糖保留率为80.65%,蛋白质脱除率为61.85%,色素脱除率为62.4%。经D101树脂脱色得姬松茸多糖(ABM)为褐色粉末,多糖含量为83%(苯酚硫酸法),蛋白质含量4.4%(凯氏定氮法)。通过柱层析法对ABM进行了分离,并对所得级分得率和总多糖含量进行了测定。通过DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sepharose CL-6B柱层析依次对ABM分离,得到7个多糖级分,依次是ABM1-1、ABM1-2、ABM1-3、ABM2-1、ABM2-2、ABM2-3和ABM2-4,依次占上样多糖(ABM1和ABM2)的6.5%、18.26%、25.84%、8.7%、7.7%、5.7%和25.13%。经苯酚硫酸法测得7种多糖级分的总多糖含量依次为94.11%、93.28%、88.60%、86.12%、84.98%、82.18%和75.32%。采用高效体积排阻色谱-示差折光检测(HPSEC-RI)和体积排阻色谱光散射仪联用(SEC-LLS)分别分析各纯化级分的相对分子量、绝对分子量和高级构象。HPSEC-RI检测到7个级分分子量分布均为单一对称峰,ABM1-1、ABM1-2、ABM1-3、ABM2-1、ABM2-2、ABM2-3和ABM2-4的相对分子量(Mw)依次为1.08×106 Da、4.08×105 Da、1.13×104 Da、1.07×106 Da、4.9×105 Da、7.7×104 Da和1.45×104 Da。由SEC-LLS测得7种多糖级分重均分子量(Mw)依次为2.450×107 g/mol、4.727×106 g/mol、1.486×104 g/mol、8.595×106 g/mol、5.503×106 g/mol、5.302×104 g/mol、2.322×104 g/mol(结果比HPSEC-RI结果略高)。SEC-LLS检测7个多糖级分的高级构象结果显示,ABM1-1高级构象可能为柔顺链;ABM1-2、ABM1-3、ABM2-1和ABM2-2四种多糖高级构象可能为刚性链;ABM2-3与ABM2-4高级构象可能为卷曲成球状。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)、红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)的1H谱和13C谱测得各多糖级分的单糖组成和糖苷键构型。单糖组成结果显示,ABM1-1、ABM1-2、ABM2-1和ABM2-2中葡萄糖摩尔百分比依次为97.38%、95.94%、95.84%和95.98%,均高于95%,所以这4种多糖级分多糖部分均为葡聚糖。ABM1-3中葡萄糖摩尔百分比只有62.83%,还含有一定量的半乳糖(28.43%)、岩藻糖(5.54%)和甘露糖(1.46%),即ABM1-3的多糖部分主要是由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖和甘露糖组成的。ABM2-3和ABM2-4的葡萄糖摩尔百分比依次为93.12%和91.04%,高于91%,葡萄糖醛酸摩尔百分比依次为2.14%和2.40%,所以这2个级分的多糖部分是含有少量糖醛酸的葡聚糖。7种多糖级分的IR和NMR结果表明,ABM1-1、ABM1-2和ABM2-2可能有两种糖苷键α-(1→4)和β-(1→6)连接方式;ABM1-3包括β和α两种构型,而且单糖组成中有岩藻糖,糖苷键有(1→2)和(1→6)两种;ABM2-1可能有两种糖苷键α-(1→4)和α-(1→6)连接方式;ABM2-3和ABM2-4可能有两种糖苷键β-(1→6)和β-(1→3)连接方式,比例为1:1。通过MTT法体外检测姬松茸子实体多糖促进脾细胞和巨噬细胞的增殖效果。结果表明,三个剂量浓度(10、25和50μg/ml)的姬松茸多糖对正常小鼠脾细胞均有增殖效果,其中ABM、ABM1-1和ABM1-2增值率均在30%以上,具有较明显的增殖效果。三个剂量浓度(10、50和200μg/ml)的姬松茸多糖对正常小鼠巨噬细胞均有增殖效果,多糖与LPS共培养实验结果高于多糖单独作用时,也高于LPS单独作用时,说明多糖可以促进LPS激活的巨噬细胞增殖。其中ABM1-2促进LPS激活巨噬细胞增殖的效果最明显。