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目的:
乳腺癌是女性高发肿瘤之一，研究表明乳腺癌的发病与胆固醇代谢异常相关。27-羟胆固醇（27-HC）是胆固醇的代谢产物，是机体中雌激素受体(ER)的内源性调节因子，具有促进ER阳性乳腺癌细胞生长的作用。临床数据显示，乳腺肿瘤样本中27-HC含量显著上升。TCGA数据库肿瘤样本以及多种人乳腺癌细胞系表达谱分析发现，乳腺癌组织27-HC降解酶CYP7B1（氧甾酮7α-羟化酶）的表达显著低于正常乳腺组织。有研究表明，乳腺癌组织27-HC的升高与患者循环血液的27-HC浓度无明显相关性，提示肿瘤组织27-HC的升高可能由肿瘤组织局部胆固醇代谢引起。此外，也有研究显示，乳腺癌组织富含巨噬细胞，并对癌细胞的生长及迁移具有明显的促进作用。因此，深入探讨乳腺癌组织27-HC的来源、病理生理学作用以及调控机制对乳腺癌的防治具有重要意义。
方法:
1.乳腺癌细胞和单核/巨噬细胞CYP27A1表达以及27-HC分泌的检测:1）采用Western blot检测人ER阳性乳腺癌MCF-7细胞、ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞以及人单核THP-1细胞的CYP27A1和CYP7B1的表达水平;2)单核细胞分别与乳腺癌细胞共培养48h后，Western blot检测CYP27A1的蛋白变化，免疫荧光法观察共培养体系中肿瘤细胞和单核细胞CYP27A1、CYP7B1的荧光强弱;3）观察单核细胞在肿瘤细胞上清刺激48h前后CYP27A1的蛋白表达差异;4）采用ELISA法检测MCF-7、MDA-MB-231、THP-1以及THP-1衍生的巨噬细胞（100nM PMA分化）培养基中27-HC的含量;5）采用细胞增殖试剂盒检测0.1nM-1μM梯度浓度的27-HC对MCF-7细胞的增殖。
2.人乳腺癌组织样本CYP781的表达以及甲基化检测:分析TCGA肿瘤样本库中不同类型乳腺癌CYP7B1的表达以及甲基化水平;检测乳腺癌细胞系和乳腺癌组织样本CYP7B1启动子区甲基化状态，并用甲基转移酶抑制剂调整肿瘤细胞系CYP781的表达。
3.肿瘤细胞及其分泌物对单核细胞分化的影响:1）显微镜观察THP-1细胞分别与MCF-7、MDA-MB-231细胞共培养48h后的形态学变化;2）HE染色和transwell培养实验分别观察THP-1细胞在给予肿瘤细胞培养基刺激48h后的形态变化;3）检测单独给予PMA、肿瘤培养基以及两者联合作用时的THP-1巨噬细胞表型蛋白CD11b和MMP-9的表达;4）检测THP-1细胞在肿瘤培养基刺激前后CD14、CD25、CD163以及IL-10的mRNA表达;5）采用流式细胞仪检测肿瘤上清液诱导THP-1细胞膜蛋白CD163的表达;6）检测4T1（小鼠乳腺癌细胞）上清液诱导原代小鼠骨髓细胞CD206蛋白表达，以及CD86、TNF-α、IL-6、IL-1β、CD206、ARG1、PPARγ、IL-13、IL-10等基因的mRNA水平。
4.乳腺癌细胞外泌体对单核细胞分化的影响:1）采用超速离心法分别提取MCF-7和MDA-MB-231细胞培养基中的外泌体，并用电镜观察其形态;2）外泌体刺激THP-1细胞6天后，检测THP-1细胞的CD11b、MMP-9蛋白的表达以及CD14、CD25、CD163、IL-10的mRNA水平。
5.不同亚型巨噬细胞27-HC的分泌:1）提取小鼠原代腹腔巨噬细胞，分别用200ng/ml LPS或10ng/ml IL-4将其分别定向分化为M1型或M2型巨噬细胞;2）Western blot检测巨噬细胞CD206蛋白的表达，ELISA检测各巨噬细胞亚型培养基中27-HC的含量。
6.27-HC对巨噬细胞的影响:采用1μM27-HC分别刺激THP-1衍生的巨噬细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞，24h后检测细胞中CCL2、CCL3和CCL4的mRNA变化。
7.小鼠乳腺肿瘤模型的制备及其处理:将8周大的Balb/c小鼠分为两组，两组小鼠左腹侧接种4T1细胞，右腹侧分别接种4T1+正常小鼠腹腔巨噬细胞混合细胞（第一组）、或4T1+荷瘤鼠腹腔巨噬细胞混合细胞（第二组），观察肿瘤生长情况，三周后收样检测以下指标:1）血常规;2）肿瘤重量;3）主要脏器结构;4）肿瘤组织巨噬细胞浸润以及27-HC的浓度;5）RNA-seq测序:每组分别选取并提取三只荷瘤鼠左右肿瘤总RNA，进行表达谱测序分析，寻找差异表达基因并验证，分析信号通路变化等。
结果:
1.单核细胞及其衍生的巨噬细胞其CYP27A1表达量显著高于乳腺癌细胞。
2.乳腺癌组织样本中CYP7B1的甲基化显著高于正常乳腺组织。
3.乳腺癌细胞与单核细胞共培养或乳腺癌外泌体刺激可诱导单核细胞向M2型巨噬细胞分化，并且增加27-HC的分泌。
4.27-HC可促进肿瘤细胞增殖以及诱导巨噬细胞上调趋化因子CCL2、CCL3和CCLA的表达。
5.4T1小鼠肿瘤模型结果显示肿瘤内27-HC的浓度与M2型巨噬细胞含量正相关。
6.联合注射小鼠腹腔巨噬细胞和4T1乳腺癌细胞可通过影响白细胞内皮迁移途径抑制巨噬细胞的浸润。
结论:
1.大量巨噬细胞浸润乳腺癌组织是其27-HC蓄积的主要因素，一方面巨噬细胞CYP27A1的高表达使27-HC合成显著增加，另一方面肿瘤细胞CYP7B1的高甲基化导致其降解作用明显降低。
2.乳腺癌细胞外泌体具有诱导单核细胞向M2型分化的作用，通过增加27-HC的分泌促进肿瘤的生长与转移。
3.27-HC是肿瘤巨噬细胞调控微环境的一种介质。巨噬细胞分泌的27-HC通过旁分泌促进肿瘤细胞生长，通过自分泌促进巨噬细胞上调趋化因子的水平，进而诱导更多的单核细胞向肿瘤组织浸润。
乳腺癌是女性高发肿瘤之一，研究表明乳腺癌的发病与胆固醇代谢异常相关。27-羟胆固醇（27-HC）是胆固醇的代谢产物，是机体中雌激素受体(ER)的内源性调节因子，具有促进ER阳性乳腺癌细胞生长的作用。临床数据显示，乳腺肿瘤样本中27-HC含量显著上升。TCGA数据库肿瘤样本以及多种人乳腺癌细胞系表达谱分析发现，乳腺癌组织27-HC降解酶CYP7B1（氧甾酮7α-羟化酶）的表达显著低于正常乳腺组织。有研究表明，乳腺癌组织27-HC的升高与患者循环血液的27-HC浓度无明显相关性，提示肿瘤组织27-HC的升高可能由肿瘤组织局部胆固醇代谢引起。此外，也有研究显示，乳腺癌组织富含巨噬细胞，并对癌细胞的生长及迁移具有明显的促进作用。因此，深入探讨乳腺癌组织27-HC的来源、病理生理学作用以及调控机制对乳腺癌的防治具有重要意义。
方法:
1.乳腺癌细胞和单核/巨噬细胞CYP27A1表达以及27-HC分泌的检测:1）采用Western blot检测人ER阳性乳腺癌MCF-7细胞、ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞以及人单核THP-1细胞的CYP27A1和CYP7B1的表达水平;2)单核细胞分别与乳腺癌细胞共培养48h后，Western blot检测CYP27A1的蛋白变化，免疫荧光法观察共培养体系中肿瘤细胞和单核细胞CYP27A1、CYP7B1的荧光强弱;3）观察单核细胞在肿瘤细胞上清刺激48h前后CYP27A1的蛋白表达差异;4）采用ELISA法检测MCF-7、MDA-MB-231、THP-1以及THP-1衍生的巨噬细胞（100nM PMA分化）培养基中27-HC的含量;5）采用细胞增殖试剂盒检测0.1nM-1μM梯度浓度的27-HC对MCF-7细胞的增殖。
2.人乳腺癌组织样本CYP781的表达以及甲基化检测:分析TCGA肿瘤样本库中不同类型乳腺癌CYP7B1的表达以及甲基化水平;检测乳腺癌细胞系和乳腺癌组织样本CYP7B1启动子区甲基化状态，并用甲基转移酶抑制剂调整肿瘤细胞系CYP781的表达。
3.肿瘤细胞及其分泌物对单核细胞分化的影响:1）显微镜观察THP-1细胞分别与MCF-7、MDA-MB-231细胞共培养48h后的形态学变化;2）HE染色和transwell培养实验分别观察THP-1细胞在给予肿瘤细胞培养基刺激48h后的形态变化;3）检测单独给予PMA、肿瘤培养基以及两者联合作用时的THP-1巨噬细胞表型蛋白CD11b和MMP-9的表达;4）检测THP-1细胞在肿瘤培养基刺激前后CD14、CD25、CD163以及IL-10的mRNA表达;5）采用流式细胞仪检测肿瘤上清液诱导THP-1细胞膜蛋白CD163的表达;6）检测4T1（小鼠乳腺癌细胞）上清液诱导原代小鼠骨髓细胞CD206蛋白表达，以及CD86、TNF-α、IL-6、IL-1β、CD206、ARG1、PPARγ、IL-13、IL-10等基因的mRNA水平。
4.乳腺癌细胞外泌体对单核细胞分化的影响:1）采用超速离心法分别提取MCF-7和MDA-MB-231细胞培养基中的外泌体，并用电镜观察其形态;2）外泌体刺激THP-1细胞6天后，检测THP-1细胞的CD11b、MMP-9蛋白的表达以及CD14、CD25、CD163、IL-10的mRNA水平。
5.不同亚型巨噬细胞27-HC的分泌:1）提取小鼠原代腹腔巨噬细胞，分别用200ng/ml LPS或10ng/ml IL-4将其分别定向分化为M1型或M2型巨噬细胞;2）Western blot检测巨噬细胞CD206蛋白的表达，ELISA检测各巨噬细胞亚型培养基中27-HC的含量。
6.27-HC对巨噬细胞的影响:采用1μM27-HC分别刺激THP-1衍生的巨噬细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞，24h后检测细胞中CCL2、CCL3和CCL4的mRNA变化。
7.小鼠乳腺肿瘤模型的制备及其处理:将8周大的Balb/c小鼠分为两组，两组小鼠左腹侧接种4T1细胞，右腹侧分别接种4T1+正常小鼠腹腔巨噬细胞混合细胞（第一组）、或4T1+荷瘤鼠腹腔巨噬细胞混合细胞（第二组），观察肿瘤生长情况，三周后收样检测以下指标:1）血常规;2）肿瘤重量;3）主要脏器结构;4）肿瘤组织巨噬细胞浸润以及27-HC的浓度;5）RNA-seq测序:每组分别选取并提取三只荷瘤鼠左右肿瘤总RNA，进行表达谱测序分析，寻找差异表达基因并验证，分析信号通路变化等。
结果:
1.单核细胞及其衍生的巨噬细胞其CYP27A1表达量显著高于乳腺癌细胞。
2.乳腺癌组织样本中CYP7B1的甲基化显著高于正常乳腺组织。
3.乳腺癌细胞与单核细胞共培养或乳腺癌外泌体刺激可诱导单核细胞向M2型巨噬细胞分化，并且增加27-HC的分泌。
4.27-HC可促进肿瘤细胞增殖以及诱导巨噬细胞上调趋化因子CCL2、CCL3和CCLA的表达。
5.4T1小鼠肿瘤模型结果显示肿瘤内27-HC的浓度与M2型巨噬细胞含量正相关。
6.联合注射小鼠腹腔巨噬细胞和4T1乳腺癌细胞可通过影响白细胞内皮迁移途径抑制巨噬细胞的浸润。
结论:
1.大量巨噬细胞浸润乳腺癌组织是其27-HC蓄积的主要因素，一方面巨噬细胞CYP27A1的高表达使27-HC合成显著增加，另一方面肿瘤细胞CYP7B1的高甲基化导致其降解作用明显降低。
2.乳腺癌细胞外泌体具有诱导单核细胞向M2型分化的作用，通过增加27-HC的分泌促进肿瘤的生长与转移。
3.27-HC是肿瘤巨噬细胞调控微环境的一种介质。巨噬细胞分泌的27-HC通过旁分泌促进肿瘤细胞生长，通过自分泌促进巨噬细胞上调趋化因子的水平，进而诱导更多的单核细胞向肿瘤组织浸润。