乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)是一种铁结合糖蛋白,属于转铁蛋白家族。乳铁蛋白主要由粘膜上皮细胞和多形核淋巴细胞产生,并分泌到乳汁、唾液、鼻腔粘膜分泌物、泪液、肠粘液、生殖道分泌物中。乳铁蛋白的生理功能广泛,包括维持铁稳态、广谱抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等。作为一种天然免疫分子,乳铁蛋白在预防病原微生物感染和抑制过度炎症反应方面发挥关键作用。EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)在人类广泛传播,是单核细胞增多症的病因,并与多种肿瘤的发生密切相关,如霍奇金病、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌。EBV具有明显的亲B细胞嗜性。EB病毒能够选择性地黏附到B细胞表面,主要是通过病毒包膜糖蛋白与B细胞表面CD21分子(EB病毒的受体)之间的交互作用；进入细胞之后,EB病毒可使B细胞永生化。上皮细胞中也可检出EB病毒,其是潜在的致癌因素。新近研究发现,EBV能直接感染单核／巨噬细胞等多种免疫细胞,诱导细胞产生大量的炎症因子,在早期可起到抗感染作用,但过度的炎症反应可对器官造成损伤。我们的前期研究对18个湖南鼻咽癌高发家系进行了单体型分析和连锁分析,发现染色体3p21为鼻咽癌易感基因区；进一步搜索和鉴定位于此区域的抑癌基因,发现编码乳铁蛋白的LF基因是重要的候选者。利用鼻咽癌组织芯片和酶联免疫吸附实验,我们发现乳铁蛋白在鼻咽癌组织中表达显著下调或缺失,其表达水平与患者血清中的EBV VCA-IgA滴度呈负相关。我们推测,乳铁蛋白的缺失或表达下调增加了EB病毒感染的几率,并加重EB病毒感染导致的局部组织损伤。研究表明乳铁蛋白能抑制多种病毒的感染,如HCMV、HSV-1、HSV-2、HIV、HBV、HCV等。乳铁蛋白抗病毒感染的机制主要是通过其与病毒颗粒直接结合或者与靶细胞上病毒受体结合,阻止病毒吸附并进入宿主细胞。乳铁蛋白还可抑制多种病毒所致的炎症反应。但目前,仍没有乳铁蛋白抗EB病毒感染及抑制EB病毒感染性炎症的报道。本研究中,我们发现乳铁蛋白具有抗EB病毒感染和抑制EB病毒感染性炎症反应的功能,并阐明了其作用机制。1.乳铁蛋白通过竞争性结合B细胞表面分子CD21,阻止EB病毒吸附并进入B细胞在病毒黏附实验中,利用免疫荧光和细胞流式术,我们发现乳铁蛋白预处理B细胞可部分抑制EB病毒与B细胞结合。定量-PCR和荧光原位杂交(FISH)证实乳铁蛋白能抑制EB病毒进入至B细胞内。EB病毒感染B细胞主要是通过EB病毒包膜糖蛋白gp350与B细胞表面CD21分子结合介导的。乳铁蛋白表面带大量正电荷,可与多种生物大分子结合。其主要抗病毒机制之一是：与病毒受体结合以封闭病毒在靶细胞表面的结合位点。我们通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验证实乳铁蛋白与EB病毒受体CD21分子存在交互作用。乳铁蛋白可能通过竞争性地结合CD21以封闭EB病毒结合位点,从而阻止EB病毒吸附并进入B细胞。2.乳铁蛋白不影响EB病毒在B细胞中的复制乳铁蛋白具有抑制一些病毒复制的功能。本研究探讨了乳铁蛋白对EB病毒复制的影响。我们用不同浓度LF分别处理P3HR1细胞和EB病毒转化的B细胞3天、6天、15天和21天,发现：乳铁蛋白对EB病毒在B细胞中的复制无影响。3.乳铁蛋白可抑制EB病毒由B细胞向上皮细胞的传递EB病毒有明显的亲B细胞嗜性,但它也可感染上皮细胞如鼻咽上皮细胞。目前认为,EB病毒感染上皮细胞的方式主要是通过B细胞的传递。我们利用B淋巴细胞与上皮细胞共培养的系统,通过Real-time PCR和FISH实验发现乳铁蛋白可抑制EB病毒由B细胞向上皮细胞的传递。4.乳铁蛋白通过降低NF-κB的活性抑制EB病毒诱导的IL-8和MCP-1的表达EB病毒不仅感染B细胞和上皮细胞,它还能感染巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞,诱导这些细胞产生IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6等炎症因子。在感染的早期,这些炎症因子发挥抵抗EB病毒感染的作用,但过度的炎症反应会对机体局部组织造成损伤。乳铁蛋白具有抗炎作用。我们在THP1诱导的巨噬细胞中观察乳铁蛋白对EB病毒诱导IL-8和MCP-1表达的影响,结果发现：乳铁蛋白能抑制EB病毒所诱导的IL-8和MCP-1的表达上调,且对IL-8的抑制作用更为明显。NF-κB活化是炎症反应启动的核心环节。我们检测了乳铁蛋白对NF-κB活化的影响,发现乳铁蛋白可抑制EB病毒诱导的NF-κB活化。这些结果说明：乳铁蛋白可抑制NF-KB的活化,且其抑制EB病毒诱导炎症反应的作用环节位于NF-κB上游。5.乳铁蛋白通过与TLR2相互作用而抑制经TLR2激活的NF-κB通路EB病毒表面糖蛋白gp350通过与巨噬细胞表面TLR2的相互作用激活NF-κB,从而诱导MCP-1和IL-8的合成和释放。本研究中,我们通过荧光素酶报告检测证明乳铁蛋白可抑制EB病毒经TLR2通路介导的NF-κB活化。前面的结果证明,乳铁蛋白可与EB病毒受体CD21结合,由此推测乳铁蛋白可能与gp350蛋白在结构上存在相似,可能与TLR2存在相互作用。我们通过免疫荧光和免疫共沉淀证实,乳铁蛋白和TLR2存在交互作用。6.乳铁蛋白通过抑制EB病毒DNA所诱导的TLR9活化而降低IL-8的表达前面的实验证明乳铁蛋白可抑制EB病毒诱导的MCP-1和IL-8的表达,且对IL-8的抑制作用更明显。研究发现,EB病毒颗粒、DNA及多种编码产物均可刺激IL-8的分泌。EB病毒DNA被单核/巨噬细胞中的TLR9识别后,可激活下游NF-κB,进而诱导产生IL-8。我们检测了乳铁蛋白预处理对EB病毒DNA诱导IL-8表达的影响。结果显示,乳铁蛋白可抑制EB病毒DNA所诱导的IL-8表达上调。为进一步阐明乳铁蛋白抑制EB病毒DNA诱导炎症反应的机制,我们观察了乳铁蛋白处理后TLR9在内体中的定位情况,发现乳铁蛋白可以抑制TLR9的激活。提示乳铁蛋白可能通过抑制TLR9的激活从而抑制EB病毒DNA所诱导的IL-8表达。7.CD14通过促进EB病毒DNA所诱导的TLR9活化而上调IL-8的表达TLR9可识别EB病毒DNA,激活MYD88介导的NF-KB的活化,从而促进巨噬细胞中IL-8的表达。但TLR9识别EB病毒DNA的具体过程及其相关作用分子尚不清楚。新近研究表明,CD14可同时作为CpG DNA的伴侣和TLR9的共受体,促进CpG DNA向内体的转运并提高TLR9对配体的识别能力。本研究中,我们证实了CD14可促进EB病毒和EB病毒DNA所诱导的IL-8表达。8.乳铁蛋白通过与CD14的结合而抑制EBV DNA对TLR9的激活既往研究发现：乳铁蛋白可与CD14结合,抑制脂多糖诱导的炎症反应。那么,在EB病毒DNA与TLR9相互作用的体系中,乳铁蛋白是否也介导相似的作用呢?我们探讨乳铁蛋白对CD14促炎作用的影响,发现乳铁蛋白可部分逆转CD14促进EB病毒或EB病毒DNA所诱导的IL-8表达。为进一步证实乳铁蛋白通过与CD14的结合而发挥作用,我们构建了乳铁蛋白的缺失突变体(缺失了与CD14结合的部位),发现：乳铁蛋白的缺失突变体不能逆转CD14的促炎作用,而野生型的可以。我们亦探讨了乳铁蛋白抑制CD14促炎作用的机制,发现乳铁蛋白可抑制CD14和TLR9的结合。乳铁蛋白可能通过与CD14的相互作用,影响CD14与TLR9的结合,从而降低TLR9对EB病毒DNA的识别能力,减轻EB病毒诱导的炎症反应。综上所述,乳铁蛋白可抑制EB病毒感染B细胞和鼻咽上皮细胞。乳铁蛋白抑制EB病毒感染B细胞主要是通过与EB病毒受体CD21的结合,从而阻止病毒黏附并进入B细胞。乳铁蛋白对EB病毒在B细胞中的复制无影响。乳铁蛋白可抑制EB病毒诱导的炎症反应,其作用机制主要包括两个方面：乳铁蛋白与TLR2结合,抑制EB病毒包膜糖蛋白gp350诱导的炎症反应；乳铁蛋白通过与CD14的相互作用,阻止CD14与TLR9的结合,从而抑制EB病毒DNA经TLR9通路所诱导的炎症反应。