除造血干细胞外，骨髓中还存在极少量的间充质干细胞（MSC），在体外特定的培养条件下可以大量扩增，并保持其向骨、软骨、脂肪、腱、肌肉、神经及基质细胞等组织的多向分化能力。MSC 的自我更新能力和多向分化能力，使其在临床上具有巨大的治疗潜力。MSC 易于外源基因的转染和表达，MSC 携带的外源基因表达具有组织特异性，可定位于缺陷组织，如对某种基因突变所致遗传病，可分离自体 MSC，体外进行改造，敲除突变基因，导入正常基因，再回输体内。 此外，MSC 通过分泌可溶性分子如 TGF-β、HGF 及细胞间接触抑制细胞或有丝分裂原引起的 T 细胞增殖，且这种抑制效果随着 MSC 参入量的增多而增强。但MSC 并不诱导 T 细胞的凋亡及无能，去除 MSC 后 T 细胞经再次刺激还可增殖。 MSC 作为骨髓基质细胞的前体细胞，除可形成骨髓微环境外，还同基质细胞一样，表达多种造血相关因子。体外以 MSC 为滋养层短期培养可促进 HSPC 扩增，长期培养可以支持 LTC-IC。体内 MSC 具有改善骨髓微环境，促进造血重建的作用，肿瘤患者接受大剂量化疗后，进行自体 CD34＋细胞联合自体 MSC 移植后，造血能力迅速恢复，外周血中性粒细胞和血小板平均恢复时间明显缩短。 目前所报道的 MSC 主要来源于骨髓，在取材过程中及取材后造成感染的危险性很高，且人体骨髓中 MSC 的含量极其稀少，每 105-106个单个核细胞中大约只有1 个，随着年龄的增加，骨髓中 MSC 的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。 MSC 来源于胚胎发育期的中胚层，胎盘起源于胚胎发育期的胚外中胚层，含<WP=96>吉林大学博士学位论文 中文摘要有大量的间充质成分。因此，我们设想，在胚胎发育时期，胚外中胚层的多能干细胞可能有少量的未被招募发生分化，而以静止形式存在于胎盘组织中，如果能从胎盘中分离培养出 MSC，将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。 自 1989 年第一例脐血移植成功以来，人们已经对脐血移植进行了深入广泛的研究。与成人骨髓移植相比，脐血来源广泛，采集容易；脐血中的 HSC 具有更强的增殖分化能力；脐血中免疫细胞不成熟，使其在移植中 GVHD 的发生率及严重程度均较低。但到目前为止，脐血移植仍存在一些尚待解决的问题，主要在于：脐血 HSPC 绝对数量少，移植后造血重建恢复的时间延迟，植入率较低，影响脐血移植的广泛开展。如何扩增脐血 HSPC 的数量，提高其植入率，缩短造血重建恢复时间，已经成为目前人们对脐血移植研究的主要方向。 众所周知，体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境，主要通过骨髓内细胞与细胞间的相互作用、基质细胞产生的生长或抑制因子以及细胞基质与造血细胞间的相互作用来调节造血功能。存在于骨髓中的 MSC 是骨髓基质细胞的前体细胞，可形成骨髓和外膜间质细胞，构成造血的微环境，形成结缔组织骨架并产生细胞因子、化学因子和 ECM 来调节造血细胞的归巢和增殖；分泌多种造血因子，并能表达多种表面粘附因子，在造血调控中具有一定的作用。因此，骨髓 MSC已被用来体外支持脐血 HSPC 扩增，体内联合移植促进植入。 但是，脐血 HSPC 与骨髓 HSPC 具有很多不同的生物学特性，这与其所处的独特的微环境是分不开的，而脐血 HSPC 缺乏与之相适应的自体培养基质，从而建立与之相适应的造血微环境来促进其扩增和植入。在体内脐血造血细胞所接触的直接环境是脐血清，与成人外周血相比，脐血中的 G-CSF、GM-CSF、M-CSF 和 IL-3均较高，已经证明脐血清能有效地扩增脐血造血祖细胞，并提高脐血中 CFU-GEMM的再植入能力，对脐血细胞增殖具有重要的支持作用。脐血清中这些造血相关因子绝大多数可在胎盘上找到其相应的表达，很多研究证实胎盘组织可以表达分泌G-CSF、GM-CSF、M-CSF、SCF、EPO、IL-3、IL-6 等多种造血相关因子，说明胎盘与造血是相关的。由于与脐血一样，胎盘来源广泛，方便易得，更由于胎盘与脐血造血之间的密切关系，是否可以利用胎盘组织建立而脐血 HSC 相适应的自体培养基质，从而建立与之相适应的造血微环境来促进其扩增和提高其植入率。<WP=97>吉林大学博士学位论文 中文摘要 综上所述，如能从人胎盘中分离培养出 MSC，可以为组织工程、基因治疗提供更广阔的 MSC 细胞来源。而且以胎盘源 MSC 作为与脐血 HSPC 相适应的培养基质，建立适合脐血扩增的微环境，在植入过程中调解免疫，降低 GVHD，在脐血HSC 扩增和促进植入作用方面具有重要的价值。并且胎盘与脐血一样，同为妇产科废弃物，来源广泛，方便易得。如果此项研究成功，将有可能解决关于脐血移植方面一直困扰人们的问题，使脐血在临床上具有广泛的应用前景。 我们采用灌流法从胎盘的灌洗浸泡液中获得 MNC，并结合骨髓 MSC 的分离方法，用 1.073g/ml 的 percoll 分离低密度细胞，用 MesenCultTM 培养基培养。并通过克隆纯化，从 24 个克隆中，获得 6 个具有 MSC 表型和生长特性的?