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第一部分“铁蓄积”对小鼠骨量和成骨细胞活性及mTOR水平影响的实验研究目的:本研究旨在进一步明确铁蓄积对雄性小鼠骨量的影响,并探索铁蓄积通过成骨细胞及其mTOR影响小鼠骨量的可能机制,为“伴铁蓄积骨质疏松症”的机制研究寻找新的方向。方法:动物实验:该实验共选取16只C57BL6雄性小鼠,随机分为对照组(Ctrl组)、高铁组(Fe组),小鼠年龄均为8周龄。Fe组小鼠经腹腔注射枸橼酸铁铵(FAC)40mg/kg,3次/wk,连续注射8wk干预,Ctrl组亦经腹腔注射等量生理盐水,频次相同;所有实验小鼠均于干预后8周时处死,分离各组小鼠双侧股骨和胫骨,普鲁士蓝染色肝脏石蜡切片及肝铁定量检测观察肝铁蓄积情况;利用微型计算机断层扫描(Micro-CT)检测小鼠股骨骨微结构等参数。细胞实验:将人成骨细胞株hFOB1.19分为两组,一组为对照组(cont组),一组为枸橼酸铁铵干预组(iron组);cont组成骨细胞不做任何处理,iron组成骨细胞铺板后用200 μM浓度的枸橼酸铁铵进行干预72h,干预完成后,对两组成骨细胞分别进行碱性磷酸酶染色(ALP染色)检测成骨细胞活性、进行茜素红染色检测两组成骨细胞的矿化能力;并运用定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨相关基因(Runx2、ALP、SP7)及mTOR基因的mRNA表达,同时采用免疫印迹实验(Western Blot)检测成骨相关蛋白(Runx2、Ocn)及mTOR蛋白的表达变化。结果:动物实验结果:Ctrl组、Fe组肝组织普鲁士蓝染色及肝铁含量检测提示:Fe组小鼠肝脏铁蓄积水平与Ctrl组相比明显升高;同时Fe组小鼠的骨量与Ctrl组小鼠相比明显下降。细胞实验结果:枸橼酸铁铵干预后成骨细胞iron组与对照组cont组相比,成骨细胞的碱性磷酸酶染色和茜素红染色明显减少;成骨相关基因表达水平下降明显(Runx2、ALP、SP7);成骨相关蛋白的表达也显著下降(Runx2、Ocn);同时,iron组成骨细胞的mTOR表达在mRNA和蛋白水平均显著上升。结论:铁蓄积能够加重小鼠的骨量丢失引起“铁蓄积骨质疏松症”,同时铁蓄积能够显著抑制成骨细胞的功能活性以及矿化能力,铁蓄积可能介导成骨细胞mTOR变化进而影响小鼠的骨量。第二部分“铁蓄积”对小鼠骨内H亚型血管和血管内皮细胞的影响及机制研究目的:研究“铁蓄积”对小鼠骨内H亚型血管数量的影响,并探究铁蓄积介导成骨细胞mTOR影响血管内皮细胞的可能机制。方法:动物实验:实验共选取16只C57BL6雄性小鼠,随机分为一组对照组(Ctrl组)、另一组高铁组(Fe组),小鼠年龄均为8周龄。Fe组小鼠经腹腔注射右旋糖酐铁O.lg/(kg-wk),连续注射8wk干预,Ctrl组亦经腹腔注射等量生理盐水,频次相同;所有实验小鼠均于干预后8周时处死,分离各组小鼠双侧股骨和胫骨,并将各小鼠的胫骨制成冰冻切片,应用EMCN和CD31共染免疫荧光检测各小鼠骨内H亚型血管的数量。细胞实验:利用间接共培养的方式,将cont组和iron组成骨细胞的培养基分别用以培养两组人脐内血管内皮细胞(HUVEC)亦为cont组和iron组,并通过划痕试验检测两组血管内皮细胞的迁徙能力;运用管型形成实验(Tube-formation Test)检测内皮细胞HUVEC的成管能力,以及EMCN免疫荧光检测血管内皮细胞HUVEC的活性。同时检测两组成骨细胞中mTOR的mRNA和蛋白表达水平的变化,以及两组血管内皮细胞血管内皮生长因子受体(KDR)表达及其活化水平的变化;并利用mTOR特异性的siRNA转染iron组的成骨细胞(iron+si-MT组)观察以上指标的恢复与否,空白siRNA转染作为阴性对照组(iron+si-NC组)。结果:动物实验结果:Fe组小鼠的胫骨近端松质骨骨内H亚型血管的数量显著少于Ctrl组小鼠。细胞实验结果:经与成骨细胞间接共培养的iron组HUVEC,其细胞迁移能力和管型形成能力较cont组受抑制明显,iron组成骨细胞的mTOR水平升高后,与之间接共培养的HUVEC(iron组)的KDR的磷酸化水平却被抑制明显;经mTOR特异性si-RNA转染后(iron+si-MT组)各项指标有所恢复,转染空白siRNA后未发生明显变化。结论:铁蓄积会明显降低小鼠骨内H亚型血管的数量,铁蓄积影响骨内H血管的可能机制为:铁蓄积会激活成骨细胞mTOR水平,使血管内皮细胞表面KDR活化受限,从而使得血管内皮活性受到抑制,骨内H亚型血管数量下降影响小鼠骨量。