研究背景骨关节炎(OA)是老年人常见的疾病,其致病原因多样化,而继发性滑膜炎、进行性关节软骨的变性、破坏乃至丧失是其主要的病理表现;影像学表现为关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成;而临床表现的最终结果则是引起关节周围的疼痛、肿大、僵硬、畸形及功能障碍,在众多临床表现中关节疼痛最为突出。OA主要影响膝、髋、手以及脊柱关节等。作为一种疼痛疾病,OA严重损害身体功能,降低生活质量。神经病变损伤或感觉系统损伤引起的神经性疼痛(NP)在老年患者很常见,尤其是那些患有糖尿病(糖尿病神经病变)、带状疱疹(带状疱疹后神经痛)、腰痛(如腰椎管狭窄)、癌症和中风的患者。OA和NP均显示痛觉敏感,他们在老年病人中的共病并不罕见。当同时合并OA和NP时,治疗这两种疾病的药物都不能充分缓解症状。要改善这两种并发疾病的治疗,就有必要阐明这些条件之间的病理生理关系。关节炎后的慢性疼痛与周围或中枢神经系统的慢性神经炎症有关。在关节炎发生时,我们可以检测到许多促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17A)和趋化因子(诱导型一氧化氮合酶iNOS,内皮型一氧化氮合酶eNOS,环氧合酶-2 COX-2)在支配关节的初级传入神经元和背角神经元中均升高。这些升高的炎性介质随后增强脊髓的突触传递水平,称为“中枢敏化”,并促进神经疼痛的发展。许多关于OA的研究以对侧非损伤侧为对照,重点关注局部或同侧神经炎性改变反应。尚缺乏有关对侧神经炎性改变的相关研究,缺乏对该机制的探讨。第一部分:单关节炎(MA)、神经压迫性损伤模型(CCI)建立及疼痛行为的检测目的本研究主要经关节腔内注射完全弗氏制剂(CFA)进入右侧胫跗骨关节间隙,建立单关节炎模型,并测定其是否影响对侧疼痛行为;通过环扎坐骨神经建立神经性疼痛坐骨神经压迫性损伤(CCI)动物模型,进一步观察对侧MA是否影响神经疼痛行为,从而明确MA对对侧神经压迫性损伤的影响。同时为了进一步确定该影响与二者诱导顺序是否有关,我们改变诱导顺序进一步观察其对疼痛行为的影响。方法:1.1.单关节炎(MA)模型建立及疼痛行为的检测1.1.1制备MA模型:选取大鼠16只,分为两组(对照组及单关节炎组,n=8);在异氟烷吸入麻醉下给大鼠右胫跗关节注射50μL CFA诱导MA。空白对照组大鼠关节内注射50μL无菌盐水。注射CFA后的大鼠右脚踝明显肿胀,剔除右脚踝没有或有轻微肿胀的动物。1.1.2单关节炎对对侧疼痛的影响:随机选取空白对照组和MA组大鼠各6只进行实验,自诱导前4天开始进行疼痛检测,包括机械刺激缩足阈值、热刺激缩足反应潜伏期测定。测定时间分别为诱导前4天、2天,诱导MA后0天、2天、4天、6天、8天、14天、21天。1.1.3组织学证实:注射2周后对空白对照和MA组各随机选择一只大鼠处死,将右侧下肢离断,胫跗关节进行5μm切片后行HE染色。显微镜观察可以看到MA大鼠胫跗关节出现病理损害,包括胫骨和跗骨变形;强化的单核浸润;滑膜细胞增生。由此可以证实我们成功建立了单关节炎模型。1.2神经压迫性损伤模型建立及疼痛行为的检测1.2.1 CCI模型的建立:将大鼠采用腹腔注射戊巴比妥钠法麻醉,显露并分离左侧坐骨神经,使其部分游离裸露。用四根丝线松散地绑在坐骨神经周围并打结,两根相邻的结之间间隔1mm,仅阻塞但不阻断神经外血流。制备CCI动物模型。1.2.2 CCI后疼痛行为检测:选取三组实验动物,空白对照组(胫附关节注射生理盐水)、CCI组、CCI+MA组(CCI后两天对侧胫跗关节注射CFA)。自诱导前4天开始进行疼痛检测,包括机械刺激缩足阈值(PWT)、热刺激缩足反应潜伏期(TWL)测定。测定时间分别为诱导前4天、2天,诱导MA后0天、2天、4天、6天、8天、14天、21天。由此观察CCI以及CCI联合对侧MA对疼痛行为的影响。1.3增加神经压迫性损伤前诱导单关节炎及疼痛行为检测1.3.1为进一步确定两种模型诱导的先后顺序对疼痛行为是否产生影响,更改诱导顺序,在CCI之前2天诱导MA:右侧胫跗关节注射CFA;CCI组及对照组注射生理盐水。1.3.2神经压迫性损伤模型建立:通过结扎坐骨神经建立CCI模型。1.3.3疼痛行为的检测:按照预实验方案进行PWT和TWL测定,时间分别为诱导CCI前4天、2天,CCI诱导后0天、2天、4天、6天、8天、14天、21天。结果1.通过诱导MA后病理切片,我们发现MA大鼠胫跗关节出现病理损害,包括胫骨和跗骨变形;强化的单核浸润;滑膜细胞增生,建立单关节炎模型成功。无论是单纯对侧MA组还是对照组,术前及术后3周内机械刺激缩足阈值及热刺激缩足反应潜伏期时间均无统计学差异。2.而在CCI模型建立后,与对照组相比,机械刺激缩足阈值和热刺激缩足潜伏期均显著降低,持续3周,证实成功建立CCI-神经性疼痛模型,显示机械刺激超敏和热痛觉过敏。与CCI组相比,CCI后2天诱导的对侧的MA组,CCI-相关的机械刺激超敏在2天时加重,而热痛觉过敏在4天加重(结果有统计学意义),这种疼痛过敏的恶化持续3周。证明CCI后诱发的对侧MA加重了 CCI诱发的机械刺激超敏和热痛觉过敏。3.相似的是,CCI前2天诱导的对侧的MA组,CCI-相关的机械刺激超敏在0天时加重(图2A),而热痛觉过敏(图2B)在6天加重,同样持续3周。可以证实CCI前诱导的对侧MA加重了 CCI诱发的机械刺激超敏和热痛觉过敏。小结通过上述实验,我们成功建立了单关节炎、神经压迫性损伤动物模型,并证明该模型具有良好可重复性;同时证实了单关节炎对于对侧神经机械刺激超敏和热痛觉过敏没有显著影响;而在神经压迫性损伤模型中无论之前还是之后诱导的单关节炎均可以显著加重CCI诱发的机械刺激超敏和热痛觉过敏。第二部分:单关节炎影响神经疼痛的传导通路研究目的为了进一步研究关节炎可能引起CCI疼痛加重的机制,探究该传导通路,我们测定单关节炎模型中脊髓炎性介质的水平。方法2.1制备MA及对照组动物模型:MA组如前所述,在右侧胫跗关节注射50μLCFA;空白对照组右侧胫跗关节注射50μL生理盐水;2.2注射48小时后处死大鼠,获取左右腰段(L3-L6)脊髓,分离RNA,在变性琼脂糖凝胶中证实了 RNA的完整性,然后使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒进行逆转录;2.3将样本扩充为25 反应混合物后进行PCR检测(每份样品一式三份):首先分别检测两组模型中同侧和对侧脊髓中促炎因子mRNA水平(IL-1β、INF-γ、IL-17A以及TNFα),然后检测趋化因子(COX-2及iNOS)的mRNA水平。观察MA对两组模型同侧和对侧炎性因子的影响。结果:1.首先我们发现空白对照同侧及对侧的IL-1β、INF-γ、IL-17A以及TNFα的mRNA水平均处于较低水平,数值基本接近;与之相比单关节炎组同侧的IL-1β、INF-γ、IL-17A以及TNFα的mRNA水平显著增高(差异有统计学意义),其中IL-1β的升高最为显著,IL-17A升高幅度最低,对侧有部分升高,但差异无统计学意义。2.其次我们测定了趋化因子COX-2及iNOS的mRNA水平。可以发现对照组同侧和对侧的COX-2及iNOS的mRNA水平类似,对比无统计学差异;而单关节炎组同侧COX-2及iNOS的mRNA水平均有显著升高,与对照组相比有统计学意义,尤其COX-2升高更多。与前几种因子不同的是单关节炎组对侧iNOS的mRNA水平同样有显著升高,差异有统计学意义;与同侧相比水平略低,但差异无统计学意义。小结上述研究表明,单关节炎可以引起同侧IL-1β、INF-γ、IL-17A、TNF-α及COX-2的mRNA水平升高,但对于对侧无明显影响:单关节炎可以同时引起同侧和对侧iNOS的mRNA水平显著升高。第三部分:iNOS抑制剂(1400W)对MA对侧突触传递和痛觉敏化的抑制作用目的由于脊髓背角的iNOS水平升高已被报道与神经兴奋性和突出传递增强有关,我们接下来研究MA诱导的iNOS上调是否影响脊髓另一侧的突触传递,同时如果阻断iNOS是否会消除这种影响,并且改善MA引起的痛觉敏化。方法3.1一氧化氮合酶对突触传递的上调及其抑制作用3.1.1制备动物模型:MA组:大鼠右胫跗关节注射50 μLCFA;对照组:大鼠右胫跗关节注射50 μL生理盐水;MA+1400W组:大鼠右胫跗关节注射50 μL MA后立刻注射10 μg iNOS抑制剂(1400W);3.1.2膜片钳记录:注射48 h后处死大鼠,取出腰段脊髓,切片,置于人工脑脊液中复温,浸泡,全细胞膜片钳记录微兴奋性突触后电流(mEPSCs),当刺激效果达到最大约20 min时,分别用蔗糖基脑脊液和含Forskolin的脑脊液灌洗,比较用药前后mEPSCs的频率和振幅。从而观察MA对Forskolin活化的突触传递的影响以及应用iNOS抑制剂后的改变。3.2.CCI模型中1400W对单关节炎机械刺激超敏和痛觉过敏的影响3.2.1制备动物模型:CCI组:如前所述,用丝线环扎左侧坐骨神经,制备CC1模型;对照组:提前2天右胫跗关节注射50μL生理盐水;MA+CCI组:制备CCI前2天右胫跗关节注射50μLCFA制备对侧MA模型;MA+CCI+1400W组:制备CCI前2天右胫附关节注射50μL CFA制备对侧MA模型,同时注射iNOS抑制剂1400W1Oμg;3.2.2自制备CCI前4天开始进行疼痛检测,包括机械刺激缩足阈值、热刺激缩足反应潜伏期测定。测定时间分别为诱导CCI前4天、2天,诱导后0天、2天、4天、6天、8天、14天、21天。由此观察1400W对疼痛行为的影响。结果1.首先,采用全细胞膜片钳技术记录mEPSCs,对照组大鼠和MA大鼠mEPSCs的频率和振幅相同(图4A)。Forskolin灌注后,MA大鼠mEPSCs的增强强于对照组大鼠。在MA组大鼠中,用1400 W预处理后,对侧SG神经元中forskolin诱导的mEPSC频率和振幅的增强被减弱到对照组水平。2.其次,从疼痛行为方面测定,CCI、MA+CCI、MA+CCI+1400W组与对照组大鼠相比均出现机械刺激超敏和热痛觉过敏,且在整个实验期间均保持稳定。另外,1400W预处理使MA+CCI组的机械刺激超敏和热痛觉过敏明显减弱,达到与CCI组相当的水平。这些数据表明,对iNOS的抑制可以逆转MA诱导的对侧神经性疼痛的恶化。小结上述研究表明,MA大鼠对侧脊髓中iNOS的上调有助于增强Forskolin诱导的促进突触传递作用,而使用1400W会消除Forskolin对MA大鼠mEPSCs的增强作用。同时,1400W可以逆转MA诱导的对侧神经性疼痛的恶化。结论综上所述,我们的证据表明,初始局限性关节炎可以导致对侧脊髓iNOS水平的升高。这可能反过来促进中枢敏化(兴奋性突触传播的活跃性),并加剧神经性疼痛的症状。这项研究表明,当神经性疼痛的患者合并OA时可能疼痛程度更严重。我们同时提供了证据证明,在治疗神经性疼痛和关节炎的治疗中,iNOS抑制剂可能有更有治疗前景。