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蚊是一类重要的医学媒介昆虫,可传播疟疾、登革热、黄热病、西尼罗河热、乙型脑炎等重要的人类疾病。化学防治是蚊媒防制的主要措施。因杀虫剂可以高效、快速杀灭蚊虫,在蚊媒病流行及应急情况下常作为首选措施。但是随着杀虫剂的广泛大量使用,蚊媒抗药性迅速发展,对蚊媒病的防治造成严重威胁。为制定更加高效合理的蚊媒防制及抗药性治理策略,必须首先了解抗药性发生发展及调控机制。代谢抗性是公认的抗性机制,其中细胞色素P450参与的代谢抗性研究最为广泛。MicroRNAs能够通过转录后调控影响基因表达水平进而调控相关生物进程。目前,昆虫microRNAs的研究主要集中在感染及免疫方向,microRNAs与杀虫剂抗性方面的研究仅见本实验室报告。本实验室前期的solexa测序发现miR-285在淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系中低表达。在此基础上,通过靶标预测软件初步预测了 miR-285的靶基因CYP6N23,并通过实时荧光定量PCR定量技术、体外双荧光素酶报告系统、体内基因注射技术进一步验证了 miR-285对CYP6N23的靶向调控作用及其对蚊溴氰菊酯敏感性的影响。本研究主要结果如下:1.靶基因预测结果提示,miR-285的种子序列与致倦库蚊CYP6N23、CYP6CD2、CYP4D43、CYP9J37的3’端非编码区序列能够完全反向互补配对;实时荧光定量PCR结果显示,miR-285在淡色库蚊抗性品系高表达,而CYP6N23在敏感品系高表达,提示miR-285可能调节CYP6N23的表达。双荧光素酶报告系统检测显示,加入miR-285 mimic组可使荧光读值降低,并且随着rmimic浓度的升高荧光读值呈降低趋势,进一步证实miR-285可在体外调节CYP6N23的表达。基因注射敲低miR-285的表达,CYP6N23有升高趋势,相反,过表达miR-285,CYP6N23的表达水平则降低,进而体内验证了 miR-285可以调控CYP6N23的表达。2.将miR-285 mimic注射入蚊体内,CDC bottle检测结果显示,接触溴氰菊酯后,miR-285 mimic注射组的死亡率低于对照组;相反,若注射miR-285 inhibitor,死亡率相对于对照组有升高趋势,但无统计学意义(p>0.05),可能是由CYP6N23升高倍数过低导致的。实验结果进一步验证,miR-285参与抗药性的形成。3.将CYP6N23的干扰RNA注射入蚊体后,CDCbottle检测结果显示,实验组的死亡率与对照组相比下降,即降低CYP6N23的表达后蚊对溴氰菊酯敏感性提高。表明CYP6N23与溴氰菊酯抗性的形成相关。4.miR-285 mimic注射蚊后,实时荧光定量PCR定量检测发现CYP6AA9与CYP6AG11的表达水平较对照组均升高。暗示CYP6N23这一P450基因与其他P450之间可能相互协调,共同影响蚊抗药性的形成,需要进一步研究。本研究报告了淡色库蚊miR-285通过调控CYP6N23表达参与抗药性的形成,研究结果进一步阐明抗药性分子机制提供了科学依据,并为蚊媒综合治理提供了新线索。