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研究背景系统性红斑狼疮是一种常见的自身免疫性疾病。狼疮性肾炎是影响SLE患者远期预后的主要因素之一,肾小球系膜细胞在LN的发生发展中起到了重要的作用。对系膜细胞的生理及病理功能进行研究,进而对损伤过程进行针对性的靶向治疗,可以有效地阻止LN的发生及发展。IFN通路是SLE重要的致病通路;而对于I型IFN在LN肾小球系膜细胞研究报道甚少,且在肾脏系膜细胞上调节I型IFN信号通路的机制仍然很不清楚。研究目的本实验采用分析IFN-α在MRL/lpr小鼠肾脏系膜区沉积及其诱导基因和趋化因子表达水平;在体外,以IFN-α干预小鼠系膜细胞下行RNA-Seq测序,筛选在IFN-α刺激下通过相应信号通路产生其下游趋化因子,以及探讨TLRs与IFN-α和其下游趋化因子间相关机制,以期深入研究IFN-α在狼疮性肾炎系膜细胞致炎机制和感染通过诱导TLRs与I型干扰素间的作用从而使LN加剧的发病机制。方法1.研究对象分为18只雌性MRL/lpr和18只雌性BALB/c两种品系小鼠,分别在不同月龄(3月,4月,5月)检测血清抗dsDNA抗体,补体C3,C4浓度及测尿蛋白浓度,实时定量PCR检测局部肾组织Ⅰ型干扰素诱导基因(OAS-1、Mx-1、Ly6e、IFIT1)和趋化因子(CXCL2、CCL2、RANTES、CCL19、IP-10)表达水平。应用免疫荧光技术对于Ⅰ型干扰素在小鼠肾组织的表达进行定位。2.以IFN-α(1000 unit/ml)刺激小鼠系膜细胞株后,检测Ⅰ型干扰素诱导基因IFIT1从而筛选最佳干预时间点。以最佳干预时间点Ⅰ型干扰素刺激系膜细胞,进行RNA-Seq测序,筛选在IFN-α刺激下通过相应信号通路产生其下游趋化因子,以及TLRs与IFN-α和其下游趋化因子间相关机制,信号通路并行验证实验,以及进行趋化功能试验,与鉴定效应细胞的表型。结果1.MRL/lpr小鼠分别在3,4,5月份的血清中抗dsDNA抗体,尿蛋白浓度,肾脏组织中的I型干扰素诱导基因(OAS-1、Mx-1、Ly6e、IFIT1)和趋化因子(CXCL2、CCL2、RANTES、CCL19、IP-10)表达水平均逐月升高,并且与相应月份的B/C小鼠对比差异有统计学意义(P<0.05);而血清中补体C3,C4水平均逐月降低,并且与相应月份的B/C小鼠对比差异有统计学意义(P<0.05)。2.MRL/lpr小鼠分别在3,4,5月份的肾脏病理可见系膜区病变及IFN-α荧光染色强度与相应月份的B/C小鼠对比差异有统计学意义(P<0.05),表现为系膜细胞增多,系膜区增宽和荧光度明显增强;此改变在MRL/pr小鼠上且为逐月加重表现。3.以IFN-α(1000 unit/ml)刺激小鼠系膜细胞后,在4小时Ⅰ型干扰素诱导基因IFIT1溶度最高,筛选最佳干预时间点为4小时;4.RNA-Seq测序:I型IFN诱导基因(OAS-1、Mx-1、Ly6e、IFIT1)和趋化因子IP-10表达水平均较对照组升高对比差异有统计学意义(P<0.05),而趋化因子CXCL2、CCL2、RANTES、CCL19与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05),使用ELISA和RT-PCR方法验证上述结果。RNA测序还显示细胞信号通路TLR3---TRIF---TRAF3---IKK3/TBK1---IRF3---IFN-β-IFNα/βR---STAT1---IP10和TLR3--TRIF---TRAF3---IKK3/TBK1---IRF3---IP10;RTPCR验证显示:除IFN-β外,其余基因与对照组对比差异均有统计学意义(P<0.05)。I型IFN干预系膜细胞的上清液可诱导T细胞的趋化聚集。结论1.MRL/lpl小鼠肾脏组织中,I型IFN诱导基因(OAS-1、Mx-1、Ly6e、IFIT1)和趋化因子(CXCL2、CCL2、RANTES、CCL19、IP-10)表达水平明显增高,并随着小鼠月龄增加而加剧。系膜区病变明显且有IFN-α高表达,也并随着小鼠月龄增加而加剧。2.小鼠肾脏系膜细胞株在IFN-α刺激下,I型干扰素诱导基因(OAS-1、Mx-1、Ly6e、IFIT1)有明显表达,趋化因子仅有IP-10高表达;IFN-α通过STAT1使IP-10分泌增多,后者可诱导T细胞趋化聚集。3.RNA-Seq测序显示:TLR3通过MyD88非依赖性信号转导通路可使IP-10表达明显增多。