戊型肝炎(hepatitis E,HE)是由HE病毒(hepatitis E virus,HEV)引起的一种经粪口途径传播的急性传染病,呈全球分布,是世界各地尤其发展中国家主要的健康问题之一,成为了继甲型肝炎外另一种经肠道传播的严重危害人类健康的病毒性肝炎,给社会带来了很大的危害。　　 根据中华人民共和国卫生部27种法定报告传染病疫情报告统计,HE发病率高,死亡率高,呈逐年上升趋势。近年来发现在猪等动物中也有广泛的HEV感染,使该病成为一种人畜共患病。目前,HE已被世界重视,世界卫生组织将其认定是发展中国家的一个重要公共卫生问题。　　 目前HE的检测方法主要有免疫电镜技术(IEM)、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和原位杂交。但HEV感染窗口期、患者自身免疫系统以及检测方法等多方面因为给戊肝的诊断带来了难度。因而有必要寻找一种高效、高通量和快速的HEV检测方法。　　 基因芯片技术是上世纪90年代兴起,源于计算机集成化芯片理念的一门新技术。实质就是利用Southern blot原理,在固相支持物的表面原位合成寡核苷酸探针,或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,这些被固定在基质的探针上就形成了高密度DNA微阵列。样品DNA或RNA经过荧光标记,与阵列上的探针进行杂交反应,按照碱基互补配对原则,探针特异性地结合相应被荧光标记的分子。通过对杂交信号的检测分析,得出样品的基因序列及其表达的信息,从而对基因序列及功能进行大规模、高通量、平行的研究。　　 近几年基因芯片技术越来越多的被应用于病原体的诊断,如用基因芯片检测痘苗病毒、疱疹病毒以及乙型肝炎病毒,但是关于基因芯片在戊型肝炎病毒方面的检测还未见诸文献。因此,本文立足于制备戊型肝炎病毒的检测芯片,初步探讨该方法的可行性,为进一步将基因芯片技术应用于各型肝炎病毒的检测建立一个技术平台。　　 本课题分为两个部分,具体研究结果如下:　　 一.探针的设计与芯片的杂交　　 首先对戊型肝炎寡核苷酸芯片进行了探针设计以及芯片的杂交。根据GeneBank数据库中的全基因组序列信息,利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLAST分析软件,找出HEV的保守序列,采用生物学软件oligo6.0设计60 mer寡核苷酸探针,并对其进行BLAST比对,采用了严格的遴选标准(为了保证设计的探针具有高度的特异性和灵敏度,设计时遵循以下原则:使探针Tm值在85±5℃之间,GC含量介于40％-60％,重复的单一碱基连续不超过5个,探针分子最稳定二级结构配对碱基长度少于6bp,且探针内部发夹结构不超过5个。在BLAST比对中,与其它基因的同源性小于70％,连续相同碱基的数量不超过18个),从中筛选出特异性高的24条作为检测用探针。寡核苷酸探针合成和纯化后,用芯片打印仪固定在玻片上。　　 运用限制性显示(RD)技术,用Cy3标记的通用引物标记质粒样品,首先以Sau3AI对DNA或cDNA样品进行限制性酶切,得到许多大小适合的限制性酶切片段,继而在片段两端加上合适的接头,再利用带有荧光标记的通用引物Cy3-U1进行样品标记,然后与芯片进行杂交。杂交后清洗玻片并干燥,以Genepix4110B对芯片进行扫描,分析各探针的杂交信号强弱并结合GenePix Pro 6.0软件来对结果进行分析。　　 二.芯片的优化与临床样品的检测　　 其次,进行了芯片的优化以及临床样品的检测。为了提高芯片的特异性和灵敏度,我们对探针浓度、片基的放置时间、样品浓度等杂交条件进行了初步研究。　　 结果表明,探针浓度在0.5,1,2,3μg/μL四种浓度下和荧光标记的样品进行杂交,在同等的杂交环境和芯片扫描参数条件下,四组探针信号强度之间存在显著的统计学差异,表现为0.5与1μg/μL浓度之间的差异具有显著性,而探针浓度1与2μg/μL,1与3μg/μL,2与3μg/μL之间则无明显的统计学差异。同时,片基的放置时间对芯片的杂交结果也有一定影响,制备芯片上的探针荧光信号在30天和60天放置后没有明显的荧光信号衰减差异,但是放置90天后芯片上的探针显示出了一些局部信号的减弱。其次,从样品浓度的分析结果来看,在106-1011copy/mL之间的样品浓度线性程度较好(r=0.9913)。因此,通过实验,我们认为样品浓度在105copy/mL为稀释的最低浓度水平,在实验取样时的样品浓度不应低于此水平。　　 在通过芯片的初步筛选后,确定了11条探针,并将制备的戊型肝炎寡核苷酸基因芯片初步应用于小规模的临床样品检测。由广州市传染病医院提供9例临床样品(5例临床初筛阳性患者血清样品,3例临床排除及1例正常人血清样品),采用戊型肝炎寡核苷酸基因芯片对样品分别予以实验检测,同时运用逆转录PCR(RT-PCR)对芯片的实验结果进行平行检测。　　 其方法是,从临床样品的血清中抽提出病毒RNA,逆转录后用RD标记使样品标上荧光物质,然后与筛选出来的11条高灵敏度高特异性的HEV寡核苷酸探针、1条阳性对照探针、1条阴性探针以及1条空白探针进行杂交,芯片洗脱,扫描后采用GenePix Pro 6.0软件进行结果分析。同时实验中运用RT-PCR的方法分别针对不同基因型的戊型肝炎病毒进行鉴定,并与芯片检测的结果相对照。杂交结果表明,芯片的特异性和灵敏度较高,阴性对照和阳性对照在芯片上均发挥着较为可靠的检测功能。同时,基因芯片的结果避免了假阳性和假阴性和窗口期结果无法检测等因素的影响,为戊型肝炎的早期诊断提供了一种较为有效的检测手段。　　 综上所述,本研究自行设计制备了戊型肝炎寡核苷酸芯片,并用于实验条件的优化和临床样品的检验。结果表明,HEV寡核苷酸芯片的特异性和灵敏度均较好,为临床HEV寡核苷酸检测芯片的研制提供了理论基础和实验验证,可望对早期戊肝流行的快速诊断和预防做出贡献。