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目的:帕金森病是第二大常见的神经退行性疾病,是最常见的运动障碍性疾病。帕金森病的核心表现是黑质致密部多巴胺能神经元的进行性死亡所导致的神经退行性改变以及由此导致的基底节区纹状体多巴胺含量的下降所引起的运动障碍。程序性坏死是由RIP1/RIP3/MLKL通路所介导的细胞程序性、可调控性坏死。最近研究发现,程序性坏死参与多种神经退行性疾病的病理发生机制中。然而,程序性坏死在帕金森病中的作用及机制尚不清楚。本课题拟探讨RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性坏死在帕金森病发生发展中的作用及可能机制。方法:本实验以8-10w雄性C57BL/6小鼠作为实验动物,用MPTP腹腔注射法制作帕金森病急性模型,通过RIP1蛋白激酶的特异性抑制剂Necrostatin-1腹腔注射进行药物处理和采用RIP3/MLKL基因敲除小鼠进行基因干预程序性坏死通路的活性,联合应用免疫组织化学染色法、高效液相色谱分析法、蛋白印记法、免疫荧光双标法、TUNEL细胞凋亡检测法以及q RT-PCR法等技术手段,探讨:1.RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性坏死在MPTP诱导的小鼠帕金森病模型黑质致密部多巴胺能神经元中的表达情况。2.通过Necrostatin-1腹腔注射进行药物干预,明确药物调控RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性坏死对MPTP诱导的小鼠帕金森病模型黑质致密部多巴胺能神经元丢失的影响以及对纹状体多巴胺含量的影响,以此阐明Necrostatin-1对MPTP诱导的小鼠帕金森病模型的脑损伤保护作用及机制。3.采用RIP3/MLKL基因敲除小鼠进行实验,研究基因干预RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性坏死的激活对MPTP诱导的小鼠帕金森病模型黑质致密部多巴胺能神经元丢失以及对纹状体多巴胺含量的影响,并阐明RIP3/MLKL基因敲除的脑保护机制与程序性坏死相关,而独立于凋亡机制。4、细胞坏死会释放大量的损伤相关分子模式,从而引起组织的炎症反应;而炎症反应反过来又会加重细胞的程序性坏死,从而形成恶性循环,加重组织损伤。因此,本实验进一步采用RIP3/MLKL基因敲除小鼠进行实验,研究基因干预RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性坏死的激活对MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中脑组织神经炎症反应的影响。结果:MPTP处理后第1天、第4天、第7天和第21天,免疫印记法可见小鼠中脑组织RIP3表达明显增加,并在第7天达到高峰,这一变化趋势与中脑黑质多巴胺能神经元的数量和纹状体多巴胺含量的变化呈正相关。免疫荧光双标法可见MPTP处理后第7天,小鼠中脑组织RIP1/RIP3/MLKL高表达并共定位于TH阳性的多巴胺能神经元中,而蛋白印记法检测进一步发现T231位点和S232位点磷酸化的RIP3以及在S345位点磷酸化的MLKL相对于对照组表达也显著增高。Nec-1可下调MPTP小鼠帕金森病模型RIP1/RIP3/MLKL通路所介导的程序性坏死的激活,并可减少中脑黑质致密部中多巴胺能神经元的丢失和纹状体多巴胺含量的下降。基因敲除RIP3/MLKL对MPTP小鼠帕金森病模型的脑损伤具有保护作用,其保护机制在于RIP3/MLKL基因缺失抑制了MPTP帕金森病小鼠多巴胺能神经元的程序性坏死,而与细胞凋亡没有显著相关性。炎症反应是MPTP小鼠帕金森病模型的病理表现之一,通过抑制RIP3/MLKL通路所介导的程序性坏死可部分减轻MPTP小鼠中脑的炎症反应。结论:该研究表明RIP1/RIP3/MLKL介导的程序性坏死参与MPTP小鼠帕金森病模型的病理发生机制中。通过药物Necrostatin-1干预程序性坏死通路的激活,可部分减轻MPTP小鼠帕金森病模型中脑黑质致密部多巴胺能神经元的丢失和纹状体多巴胺含量的下降,提示Necrostatin-1对帕金森病的脑损伤具有潜在的神经保护作用;RIP3/MLKL基因敲除可明显减轻MPTP帕金森病小鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元的丢失和纹状体多巴胺含量的下降,其机制与RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性坏死相关,而独立于细胞凋亡机制;另外,基因敲除RIP3/MLKL也可通过抑制细胞的程序性坏死而部分减轻帕金森病小鼠中脑组织的炎症反应。因此,靶向调控多巴胺能神经元的程序性坏死有望成为帕金森病新的潜在治疗靶点。