论文部分内容阅读
近年来,随着外科技术、器官保存方法和免疫抑制剂的临床应用等领域的进步,肝移植受体的生存期已明显延长。然而,细胞介导的移植物急性排斥反应仍是器官移植后长期存活的主要障碍之一。据统计,肝移植后的急性排斥反应发生率约为40%～70%,并终将导致部分受体移植肝功能丧失。目前临床移植后治疗急性排斥反应主要依赖于非特异性的免疫抑制剂治疗,这些免疫抑制剂几乎完全抑制人体的免疫系统,显著增加病人罹患感染和肿瘤的危险性。因此,开发新型的免疫抑制剂,防止移植物排异反应一直是器官移植领域的研究热点。 骨化三醇是维生素D的活性形式,是调节钙磷代谢重要的内源性激素。近年来的研究证实骨化三醇具有广泛的免疫调节作用。多种免疫活性细胞如胸腺细胞、骨髓前髓细胞、外周血单个核细胞、巨噬细胞及活化的T细胞等细胞核内存在维生素D受体(VDR)。骨化三醇与VDR的结合,可以影响转录因子的活性,导致目的基因转录的激活或抑制。研究证实,骨化三醇可以直接抑制Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1类细胞因子,并可以直接刺激Th2细胞分泌IL-4,IL-5和IL-10等Th2类细胞因子。同时骨化三醇可以抑制B淋巴细胞分泌IL-12,进一步抑制T淋巴细胞的分化和活化。对抗原递呈细胞,体外研究证实骨化三醇可以明显抑制树突状细胞(DC)表达MHCII类分子及B7.1、B7.2分子和CD40等表面标志,影响共刺激信号的传导。同时,其他研究证实骨化三醇可以直接抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)介导的细胞毒性。新近的多个研究尚证实骨化三醇可以诱导致耐受型DC利调节性T细胞(Treg)的产生,从而调节免疫反应。浙江大学博士学位论文 骨化二醇在体内的免疫调几}y作用近年亦得到少’‘泛的研究。一些研究认为骨化二醇可以延长多种非血管化或血管化器官如皮肤、心脏和肾脏等移植后移植物的生存期,并可以避免传统的免疫抑制治疗后常见的感染、骨质疏松等副作用。但亦有一些研究认为骨化二醇并不能明显延长移植物存活期。因而J骨化二醇在器官移植后排斥反应中的作用不能定论。 移植宿主启动急性排斥反应实施对移植物的损伤是一个非常复杂的过程,由各种免疫活性细胞和多种蛋白质共同参与完成,T细胞的增殖、活化是其中心环一竹。在同种移植中,静!卜的T淋巴细胞识别抗原递呈细胞(APC)递呈的抗原后活化,在共刺激因子的协同作用下,合成、分泌白细胞介素2(IL一2)和自细胞介素2受体(!L一ZR),推动丁淋巴细胞由GO期进入Gl期,开始增殖。T淋巴细胞增殖后进一步分化为细胞毒性T淋巴细胞(C下L)和辅助性下细胞(Th)。CTL通过穿孔素和颗粒酶B途径或Fas IFasL途径,导致靶细胞表面发生致死信号,并通过细胞浆内Caspase蛋白家族和Bd一2蛋白家族的传导,进一步将细胞表面信号传导至细胞核内,使细胞核内染色体发生断裂,细胞凋亡,最终导致移植物失功。T卜细胞则通过分泌相应的细胞因子,使体内细胞因子网络向启动急性排斥反应的Thl型或向诱导免疫耐受的ThZ型发生偏移,实现对移植后免疫反应的调节。 骨化三醇对原位肝移植后急性排斥反应的调节作用尚未得到深入的研究。肝脏作为一个免疫特惠器官,在移植后表现其独特的免疫反应特点。预防性应用骨化二醇对原位肝移植后的免疫反应的调节作用具有什么动态特征?凋亡途径是否参与了碑骨化三醇对移植物的保护作用?骨化三醇与经典的免疫抑制剂是否具有正协同作用?本研究针对以上问题展开,探讨骨化三醇对原位肝移植后急性排斥反应的调节作用和机理。 材料与方法 第一部分研究观察骨化二醇对大鼠原位肝移植后急性排斥反应的调节作用。建立大鼠原位肝移植模型,实验分4组进行:!织.为Wistar*晰star同基因移植组(Syn grouP);一l至日.为SD、Wjstar急性排斥组(Rej grouP);l!I组SD、WIStar CsA处理织一(CSA group),原位肝移植后应用环抱霉素A(CsA)3.omg.kg一1.d一,腹腔内注射,移植后。一13大用药;Iv组SD、晰 star谓,化二醇处理爹R(Caleitriol group):原位肝移植后应用骨,化二醇(Calcitriol)1.opg.kg一,.d一1腹腔内注射,移植后。一13大用药。各组分别于移植后1、3、5、7、12、3od浙江大学博士学位论文各处死3例受体采集标本,并每组留取6例受体观察移植后一般情况和存活时间。测定移植后各个时点移植物功能和受体外周血Ca十十浓度;观察移植物急性排斥反应病理学特征;采用单向混合淋巴细胞反应检测移植后受体脾脏单个核细胞对异体抗原刺激的反应能力;采用流式细胞技术分析移植后受体外周血CO4、COS细胞的含量并计算CO4lCOS比例;采用EUSA方法测定移植后受体外周血IL一2,4,10和IFN一Y等细胞因子浓度;采用蛋白印迹(W白stem以。tting)方法检测移植物局部细胞因子蛋白表达量;采用免疫组织化学方法检测移植物局部CO4、COS及CO25阳性细胞浸润程度。 第止部分研究观察骨化二醇对移植后肝脏细胞凋亡的影响。利用第一部分采集的标本,采用下UNEL技术和透射电镜技术观察移植物细胞形态学特征,采用免疫组织化学方法或蛋白印迹方法检测移植物局部凋亡相关蛋白Caspase一3,Bax,Bcl一 xL,Bcl一2等的表达。 第二部分研究观察骨化二醇和CsA联用是否具有正协同作用。利用