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风味酯是最重要的一类呈香化合物,对酒类饮品风味质量至关重要。白酒中的风味酯主要分为两大类,一类是以乙酸乙酯为主的乙酸酯,另一类是以己酸乙酯为主的中短链脂肪酸乙酯（C4-C10）。选育适量高产风味酯的酿酒酵母,对于稳定和提高酒类产品质量以及对中国白酒传统酿造工艺革新都具有重要意义。在酿酒酵母中,酯类物质主要是以酰基辅酶A和乙醇作为底物通过醇酰转移酶（AATase）催化而成。因此,本论文主要从强化酰基辅酶A的底物合成和提高AATase酶活力水平两个角度出发,通过代谢工程和诱变育种技术对酿酒酵母细胞进行改造,从而强化了酿酒酵母对乙酸乙酯和中链脂肪酸乙酯（C6-C10）的合成能力。主要研究内容及结论如下:（1）胞浆乙酰辅酶A合成能力的强化及高产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的选育。通过使用不同强度的终止子对酿酒酵母胞浆PDH旁路的两个关键基因ACS1（SAG1t,MFA2t和PGK1t）和ALD6（GIC1t,PGK1t和CPS1t）的表达水平进行了组合优化,成功得到了一系列能够产不同浓度乙酰辅酶A的酿酒酵母突变株,其中最高产菌株（PG）的乙酰辅酶A产量是最低产菌株（SC）的4.08倍。乙酰辅酶A生成量最高的菌株PG,是通过带有PGK1t终止子（使得ACS1基因单独过表达时转录水平最强）的ACS1基因和带有GIC1t终止子（使得ALD6基因单独过表达时转录水平最弱）的ALD6基因共过表达而得。乙酰辅酶A生成量最低的菌株SC是通过带有SGA1t终止子（使得ACS1基因单独过表达时转录水平最弱）的ACS1基因和带有CPS1t终止子（使得ALD6基因单独过表达时转录水平最强）的ALD6基因共过表达而得。说明PDH旁路中的两个关键基因的过表达对于生成乙酰辅酶A来说,并不是使得基因转录水平最强的终止子和最强的终止子组合到一起才会达到最好的效果,这些不同强度的终止子的使用为从转录水平强化单个蛋白质的表达以及平衡各酶之间的通路表达水平提供了一个灵活有效的方法。为了强化AATase的活力水平,在上文中乙酰辅酶A合成能力强化的菌株中过表达了酿酒酵母自身的AATase基因ATF1,所检测的乙酸乙酯的产量均较其对应的出发菌有明显的提高,其乙酸乙酯产量最高的菌株是PG-A（出发菌PG具有最高的乙酰辅酶A合成能力）,产量为1.27 g/L。随后,本研究进一步引入了产酯酵母和水果来源的四种AATase基因,乙酸乙酯的合成能力有了进一步提高,其中产量最高的菌株是PG-Ae（Ae AT9基因引入菌株）,达1.37 g/L,是对照菌株PG的169.40倍,是PG-A菌株的1.08倍。随后,以PG-Ae为出发菌敲除了四个基因（POR2,MPC2,PDA1和YAT2）,限制了胞浆丙酮酸和乙酰辅酶A到线粒体的运输以及部分阻断了线粒体中丙酮酸到乙酰辅酶A的转化。最后发现,限制丙酮酸到线粒体的运输,即敲除POR2基因（PG-Ae△POR2）,乙酸乙酯的产量有了进一步提高,产量为1.61 g/L,是对照菌株PG-A的1.18倍。然而,MPC2,PDA1或YAT2基因的进一步敲除,影响了细胞的生长,导致了乙酸乙酯的产量分别下降了13.37%,19.06%和29.19%。最后用乙酸乙酯产量最高的菌株PG-Ae△POR2进行发酵工艺优化,在最优的发酵条件下,乙酸乙酯的产量可达1.69 g/L,这是迄今为止通过代谢工程改造方法得到的乙酸乙酯产量最高的酿酒酵母菌株。（2）脂肪酸合成酶（FAS）基因的定向突变首先以酿酒酵母AY14α为出发菌,构建了中链脂肪酸生物传感器,并以该生物传感器细胞作为研究对象,进行ARTP诱变处理,得到大规模的突变文库,随后利用了FAS抑制剂浅蓝菌素作为一级筛选的工具,以传感器的荧光检测作为二级筛选的方法,成功构建了高通量筛选正突变体的方法。利用高通量筛选方法,本研究得到了三株中链脂肪酸乙酯产量较高的突变体,酯产量最高的突变株是#432,己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的产量分别为为3.06、3.80、2.66 mg/L,是对照的11.76、2.71和2.38倍。将该突变株的FAS1和FAS2基因进行测序分析发现,该菌株的FAS2基因有单个氨基酸位点发生替换,即1334位点的Asp氨基酸被替换成了Gly氨基酸。最终本研究成功得到了突变体基因FAS2Asp1334Gly。（3）高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母菌株的选育以前期构建的胞浆乙酰辅酶A合成能力强化的酿酒酵母菌株PG△POR2作为出发菌,过表达了ACC1（Ser659,1157Ala）基因（PG△PA）,促进碳代谢流由乙酰辅酶A流向丙二酸单酰辅酶A。随后在FAS1基因过表达的基础上,过表达了野生型FAS2基因以及突变基因FAS2Asp1334Gly（PG△PAF1F2*）,强化中链酯酰辅酶A的合成,并且该突变体基因的过表达优于野生型FAS2基因的过表达。最终引入特异性较强的草莓来源的AATase基因SAAT,催化中链酰基辅酶与乙醇发生反应生成中链脂肪酸乙酯,成功得到了中链脂肪酸乙酯产量相对较高的重组菌株PG△PAF1F2*S。其己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的浓度分别为11.97、17.19和17.32 mg/L,是出发菌AY14α的46.04,12.28和9.02倍。