舞毒蛾作为世界性森林重大害虫之一,能取食500余种植物,对森林造成了严重危害。杨树为舞毒蛾喜食的寄主植物之一。为了探究杨树次生物质对舞毒蛾幼虫生长发育和解毒功能的影响,根据杨树叶片内次生物质含量变化,选取了6种主要次生物质和3组含有特征性次生物质的联合处理,分别如下:咖啡酸、水杨苷、芦丁、槲皮素、邻苯二酚、黄酮、联合处理1(水杨苷和黄酮)、联合处理2(水杨苷、咖啡酸和邻苯二酚)和联合处理3(黄酮、咖啡酸和邻苯二酚)。分别将上述9种处理添加至人工饲料中饲喂舞毒蛾2龄幼虫,观察测定连续15d幼虫体重和存活率的变化、2龄幼虫发育历期、取食量及拒食效果与营养利用情况,综合评价不同次生物质对舞毒蛾幼虫生长发育及营养利用;测定舞毒蛾体内细胞色素 P450(Cytochrome P450,P450)、谷胱甘肽 S 转移酶(Glutathione S-transferase,GST)、羧酸酯酶(Carboxylesterase,CarE)和乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase,AChE)活性的变化。根据杨树主要次生物质诱导解毒酶活性程度结合已有研究报道,选取25个CYP和13个GST基因作为候选基因,利用实时荧光定量RT-PCR研究了 CYP和GST基因在不同发育阶段和次生物质处理后表达模式;筛选出可被次生物质诱导的相关基因(LdCYP4L23、LdCYP6AB37、LdCYP9A54v1、LdCYP332A6、dGSTe1和LdGSTo1),进一步利用 RNAi 技术探讨这些基因对次生物质的解毒功能,主要研究结果如下:1、不同杨树次生物质对舞毒蛾幼虫体重和存活率的影响不同。黄酮、联合处理1和联合处理3处理7d后幼虫全部死亡;饲喂15d后,咖啡酸、水杨苷、芦丁、槲皮素和联合处理2处理组的幼虫体重降低,并且联合处理2的幼虫存活率和体重均低于咖啡酸、水杨苷和邻苯二酚处理组。联合处理2组幼虫2龄的发育时间比对照组(4.78d)显著延长,为5.61d。舞毒蛾幼虫的取食量和拒食率测定结果显示2龄幼虫取食含次生物质的饲料,其取食量均有不同程度的降低。其中,黄酮处理组拒食率最高,为87.58%;食物选择性结果发现黄酮处理组人工饲料上的幼虫显著低于对照组。营养利用结果表明黄酮、联合处理1和联合处理3处理组的幼虫相对取食量、相对生长率、食物利用率和食物转化率均降低,但近似消化率高于其他处理组。2、杨树次生物质影响舞毒蛾幼虫解毒酶活性,P450和GST活性在12h～72h均被咖啡酸、水杨苷、芦丁、槲皮素、邻苯二酚、黄酮、联合处理1、联合处理2和联合处理3诱导增加,次生物质处理的人工饲料饲喂12h后,联合处理3组P450活性最高,为对照组的6.83倍;邻苯二酚处理组的GST活性最高,为对照的3.40倍。CarE活性在12h～24h受到咖啡酸、水杨苷、芦丁、槲皮素、邻苯二酚、黄酮、联合处理1、联合处理2和联合处理3的抑制,处理12h后联合处理1的抑制效果最显著,为对照的50.78%。AChE活性随着时间的延长而受到抑制,经咖啡酸、水杨苷、芦丁、槲皮素、邻苯二酚、黄酮、联合处理1、联合处理2和联合处理3的处理72h后,AChE活性表现为抑制降低,其中水杨苷的抑制率最高为67.73%。3、舞毒蛾25个CYP和13个GST基因在卵、幼虫、蛹和成虫阶段均有表达,但表达水平不同。其中,LdCYP4L23、LdCYP4G81、LdCYP9A56、LdCYP332A6、LdGSTt1、LdGSTd2、LdGSTe1、LdGSTe2、LdGSTe3、LdGSTo2 和 LdGSTs2 基因同卵期相比,均在1～3龄幼虫发育阶段表现为上调表达,这可能与幼虫期需要大量摄食寄主植物次生物质有关。经不同次生物质处理后,舞毒蛾25个CYP基因和13个GST基因表达水平存在差异。咖啡酸、水杨苷、芦丁、黄酮、邻苯二酚、联合处理1、联合处理2和联合处理3处理组均能诱导LdCYP9AB37基因的表达,联合处理2的诱导效果最高为对照的46.12倍。LdCYP4L23和LdCYP6AB37基因能被水杨苷、槲皮素、黄酮和联合处理3诱导表达,为对照的2.07倍～8.79倍。LdCYP332A6基因的表达量可被咖啡酸、水杨苷、芦丁和联合处理3诱导,其诱导范围为对照的1.50倍～2.63倍。在GST家族基因中,水杨苷能诱导LdGSTd1 LdGSTo1和LdGSTz1基因的表达,分别为对照的3.80倍、3.15倍和29.24倍。LdGSTe1基因的表达量可被水杨苷、芦丁、联合处理1、联合处理2和联合处理3诱导上调,其诱导范围为对照的1.83倍～8.66倍。4、利用RNAi技术沉默舞毒蛾3龄幼虫LdCYP4L23、LdCYP6AB37、LdCYP9A54v1、LdCYP332A6、LdGSTe1和LdGSTo1基因,不同基因被有效沉默时间点不同。LdCYP332A6、LdGSTe1和LdGSTo1的相对表达量在沉默48h最低,沉默效率最大,分别比对照dsGFP组降低了 84.00%、46.18%和79.87%;而LdCYP4L23和LdCYP9A54v1基因在72h沉默效率最高,分别为66.00%和49.06%;LdCYP6AB37基因在沉默120h有最大的沉默效率,为66.57%。测定以上基因舞毒蛾沉默体幼虫的体重、存活率及营养利用效率,与注射dsGFP的对照组相比,LdCYP4L23、LdCYP6AB37、LdCYP9A54v1、LdCYP332A6、LdGSTe1 和 LdGSTo1基因沉默体均未产生显著性差异。进一步将存活的舞毒蛾幼虫沉默体饲喂添加次生物质的人工饲料,探索CYP和GST基因对次生物质抗性功能。结果表明,舞毒蛾LdCYP332A6和LdGSTe1基因沉默体经芦丁喂食48h后体重分别降低了14.75%和27.81%;与对照组相比,LdCYP6AB37、LdCYP9A54v1和LdGSTo1基因沉默体取食水杨苷处理的体重在48h、72h和96h降低了 9.00%～30.73%LdCYP6AB37基因沉默体取食联合处理2饲料,其3龄发育时间与对照组(5.35d)相比显著延长至5.98d;在添加芦丁的饲料上,LdGSTe1基因沉默体3龄发育历期显著延长至5.53d(对照组为5.13d)。营养利用分析表明,LdCYP6AB37基因沉默体取食水杨苷的食物利用率和食物转化率分别降低了 2.12%和2.27%;LdGSTe1基因沉默体取食芦丁的食物利用率和食物转化率分别降低了 1.49%和2.66%。这表明LdCYP6AB37和LdGSTe1参与了舞毒蛾对水杨苷或芦丁的代谢解毒。本文从杨树中选取主要次生物质饲喂舞毒蛾幼虫,通过生长发育及取食试验的测定,发现了黄酮具有强拒食性。舞毒蛾P450和GST解毒酶能被水杨苷、咖啡酸、邻苯二酚、芦丁、槲皮素和黄酮显著诱导增加。同时,水杨苷和芦丁能显著诱导LdCYP4L23、LdCYP6AB37、LdCYP9A54v1、LdCYP332A6、LdGSTe1 和LdGSTo1基因的表达。在次生物质胁迫下,LdCYP6AB37和LdGSTe1沉默影响了舞毒蛾幼虫对水杨苷和芦丁的适应性。这些结果有助于探讨舞毒蛾对喜食寄主植物的适应性机制,为今后寄主抗性机制研究提供基础理论及培育抗性转基因杨树提供靶向基因信息。