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砷是一种常见的环境毒物，长期暴露于无机砷存在的环境中可以引起人体多系统和器官的疾病，砷暴露对地方性砷中毒病区的居民健康生活和经济发展造成严重的影响。大量砷对皮肤角质细胞影响的体内体外研究均已证实，无机砷暴露能够诱导人皮肤角质细胞凋亡，影响细胞的正常增殖和引起细胞损伤。
细胞凋亡是一种有序或程序性的细胞死亡方式，受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的生理应答反应，所以细胞凋亡又被称为细胞程序性死亡。机体正常的细胞凋亡过程调节失控，机体会失去稳定性而引发人类肿瘤、免疫系统损伤等多种疾病。一般认为，细胞凋亡的发生主要存在两条信号通路的调控机制，分别为线粒体通路（内部）和死亡受体通路（外部）。研究表明，在线粒体通路中，ROS的堆积可以导致线粒体膜脂质过氧化和功能受损，造成质子电化学梯度耗散，△Ψm降低，引起线粒体膜的破裂和蛋白质活性物质如CytC释放，继之Caspase瀑布式活化，最终引起细胞凋亡。
叔丁基对苯二酚(tBHQ)是一种常见的抗氧化剂，有研究发现，在PC12细胞和神经系统细胞中，tBHQ可以通过线粒体途径发挥抗凋亡作用，而且能够影响凋亡相关蛋白Bcl-2家族蛋白的表达。另外，tBHQ是Nrf2转移入核的强烈诱导剂，具有极强的抗氧化作用，因此，tBHQ可以通过提高细胞的抗氧化水平从而发挥保护细胞的作用。但是目前，tBHQ对砷诱导的角质细胞凋亡的可能影响尚未见报道。
综上所述，本研究拟选用人永生化表皮细胞HaCaT细胞系，探讨tBHQ在无机砷诱导HaCaT细胞凋亡过程中的作用，观察tBHQ对内源性线粒体凋亡通路和凋亡相关蛋白Bcl-2等蛋白表达的影响，试图揭示可能的机制。本研究将为预防和治疗无机砷诱导的皮肤氧化损伤效果等提供新的实验依据和线索。
研究方法
1.Annexin V/PI双染流式细胞仪法测定细胞凋亡率
2.荧光显微镜观察细胞形态改变
3.JC-1染色流式细胞仪法测定线粒体膜电位改变
4.分光光度法检测Caspase-3蛋白活力
5.Western blot法分析细胞内Caspase-3、CytC、Nrf2、Bcl-2和Bax蛋白表达水平
结果
1.tBHQ对NaAsO2致HaCaT细胞凋亡的拮抗作用
形态学观察发现，tBHQ50μmol/L预处理12 h后再暴露于NaAsO2(5，30μmol/L)细胞中凋亡细胞数，细胞核碎片和凋亡小体均减少。Annexin V/PI双染流式细胞仪测定细胞凋亡率发现，NaAsO2(10和30μmol/L)单独作用HaCaT细胞，细胞凋亡率随染砷浓度增加而升高，差异具有显著性(p＜0.01)。而tBHQ(10、25、50μmol/L)预处理后，细胞凋亡率与相同浓度NaAsO2单独作用组相比明显降低，且差异具有统计性(p＜0.01或p＜0.05)。
此外，NaAsO2单独作用HaCaT细胞，JC-1染色法流式细胞仪测定细胞线粒体膜电位破坏率随染砷浓度增加而升高，差异具有显著性(p＜0.01)。给予tBHQ预处理后，线粒体膜电位破坏率与相同浓度NaAsO2单独作用组相比明显恢复，且差异具有统计性(p＜0.01或p＜0.05)。
对凋亡相关蛋白检测发现，NaAsO2单独作用于HaCaT细胞24 h，线粒体中CytC蛋白表达降低，而胞浆中Cyt C蛋白表达则随染砷剂量的增加而明显升高。tBHQ预处理12h后再分别暴露于NaAsO2，线粒体中CytC蛋白表达明显恢复，胞浆中Cyt C蛋白表达则随tBHQ剂量的增加而明显回落。此外，NaAsO2单独作用于HaCaT细胞24 h，procaspase-3蛋白表达降低，而Caspase-3活化程度均显著高于对照组(p＜0.01)，tBHQ预处理12h后再暴露于NaAsO2，procaspase-3蛋白表达均明显高于相同浓度砷单独作用组，而且Caspase-3酶活力得到明显抑制，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。
2.tBHQ对NaAsO2致HaCaT细胞内Nrf2蛋白表达的影响
tBHQ单独作用可诱导HaCaT全细胞Nrf2和细胞核内Nrf2蛋白表达，且均明显高于对照组。tBHQ预处理再与NaAsO2共同处理，Nrf2蛋白表达均明显高于相同浓度NaAsO2单独作用组。
3.tBHQ对NaAsO2致HaCaT细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
NaAsO2单独作用于HaCaT细胞24h，与对照组相比Bcl-2蛋白表达降低，而Bax蛋白表达明显升高。tBHQ预处理12 h后再分别暴露于NaAsO2，Bcl-2蛋白表达明显恢复，而Bax蛋白表达则随tBHQ剂量的增加而明显回落。
结论：
1.tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞细胞凋亡具有一定的拮抗作用。
2.tBHQ能够影响线粒体凋亡途径拮抗NaAsO2诱导的人皮肤角质细胞凋亡。
3.tBHQ能够诱导核因子Nrf2和调控凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax从而发挥抗凋亡作用。