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研究背景与目的肺纤维化,是由多种诱因引起的肺部炎症、肺泡持续性损伤、胞外基质反复破坏、修复、重建并过度沉积,最终导致肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病。其确切的发病机制尚未完全阐明,现在仍缺乏特异有效的阻止或逆转肺纤维化的治疗手段。肺纤维化的治疗仍是一项国际难题。我们课题组研究发现,羧胺三唑(Carboxyamidotriazole, CAI)在一系列急慢性炎症模型中表现出良好的抗炎作用,并且能显著下调炎症部位促炎细胞因子的水平。因此我们提出以下设想：具有抗癌和抗炎作用的CAI是否能够通过抑制肺纤维化的始发因素——初期炎症反应,来阻断肺纤维化的进程呢?如果可以,其作用机制如何?我们围绕这些问题展开了一系列研究。研究方法通过皮下注射博莱霉素(BLM)法建立C57BL/6J小鼠肺纤维化模型。实验设对照组(CON)、模型组(BLM)和药物干预组(BLM+CAI),观察CAI(30mg/kg)对小鼠肺纤维化的影响。实验周期43天。同时探讨CAI发挥作用的可能机制。观察指标包括动物体重、肺系数、病理切片炎症评分、纤维化评分和羟脯氨酸含量。用荧光定量PCR和ELISA的方法分别检测小鼠肺脏、支气管肺泡灌洗液以及灌洗液中分离出的炎性细胞中,促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α, Th17型细胞因子IL-17A和促纤维化因子TGF-β1的mRNA水平及蛋白水平表达量,初步探讨CAI的抗炎抗纤维化作用及可能的作用机制。采用细胞系NR8383和大鼠原代肺泡巨噬细胞建立体外研究模型。用细胞计数法绘制NR8383细胞的生长曲线。采用CCK8法,检测NR8383细胞和大鼠原代肺泡巨噬细胞给予BLM和CAI后其生存力的变化。研究结果1.采用多次皮下注射BLM的方法,能够成功建立小鼠肺纤维化模型。2. CAI (30mg/kg)能有效改善BLM诱导的C57BL/6J小鼠肺纤维化。CAI对肺纤维化模型小鼠的体重有一定的改善作用,能够显著降低肺纤维化小鼠的肺系数,缓解小鼠的肺脏外观病变与皮肤色素沉积,说明CAI不仅能够降低肺内胶原蛋白沉积、缓解BLM对肺脏造成的损害,同时也能改善BLM造成皮肤色素沉积的副作用。3.CON组、BLM组及BLM+CAI组肺脏病理切片炎症评分分别为0.60+0.23,4.07+0.92和2.33+0.74,BLM组肺内炎症评分与CON组相比显著升高(p<0.01)；BLM+CAI组与BLM组相比炎症水平显著降低(p<0.01),表明BLM造模后,小鼠肺内存在慢性炎症,且CAI能够显著降低炎症水平。4.CON组、BLM组及BLM+CAI组肺脏病理切片纤维化评分分别为0.29±0.07,5.57±1.09及3.24±1.37,BLM肺内纤维化水平与CON组相比显著升高(p<0.01)；BLM+CAI组与BLM组相比纤维化水平显著降低(p<0.01),表明BLM造成小鼠肺内严重的纤维化,而CAI能够显著下调纤维化水平。5.CON组、BLM组及BLM+CAI组小鼠肺脏病理切片纤维化面积占肺脏切片总面积的比值(%)分别为0.02+0.02%,16.04±10.48%和4.74±3.38%。结果表明BLM组与CON组相比肺纤维化面积显著升高(p<0.01)；BLM+CAI组与BLM组相比显著降低(p<0.05),即CAI能够显著降低小鼠肺内纤维化水平。6.CON组、BLM组及BLM+CAI组小鼠肺脏羟脯氨酸含量分别为2.72±0.45,3.62±0.84和2.74±0.31μg/mg干重。BLM组与CON组相比,羟脯氨酸含量显著升高(p<0.05)；BLM+CAI组与BLM组相比显著下降(p<0.05),表明CAI能够显著降低小鼠肺内胶原蛋白含量。7.CAI能够显著下调IL-1β在肺组织匀浆中的蛋白水平表达(p<0.05)；能显著下调BALF细胞中IL-6(p<0.05)和TNF-α(p<0.05)在mRNA水平的表达。8.CAI能够显著降低肺组织中TGF-β1mRNA水平的表达(p<0.05)。9.CAI能够显著降低肺组织中IL-17A的蛋白水平(p<0.01)和BALF细胞中IL-17AmRNA水平(p<0.05)的表达。10.BLM与CAI对NR8383细胞的增殖都具有抑制作用,并呈浓度依赖关系。l1.较高浓度的BLM(320与640μg/mL)对原代肺泡巨噬细胞有一定的毒性作用；但不同浓度的CAI对大鼠原代肺泡巨噬细胞活力均无影响。结论CAI对BLM诱导的小鼠肺纤维化具有一定的缓解作用。根据动物实验的研究结果表明,CAI的作用与其较强的抗炎作用有关,CAI不仅能够降低促炎因子IL-lβ、IL-6和TNF-α的表达水平,还能降低Thl7型细胞因子IL-17A的表达。由于CAI对这些细胞因子的下调作用,降低了肺内炎症水平,减缓了纤维化的发展进程。此外,CAI对肺内TGF-β1的表达水平也有下调作用,提示CAI可能具有直接抗纤维化的作用。CAI不仅能够对BLM诱导的小鼠肺纤维化有较好的疗效,而且能够缓解博来霉素的另一副作用——色素沉积。综上所述,对CAI进行深入的研究,对肺纤维化疾病的临床治疗具有潜在的应用价值。