基于荧光标记DNA与聚合物纳米材料相互作用的神经退行性疾病相关靶标分析方法研究

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神经退行性疾病的机理研究和开发有效的早期检测及治疗手段是当前国内外的研究热点。荧光标记DNA探针具有操作方法简单、信号响应迅速、选择性良好、灵敏度高、不受电场、磁场的影响、对生物分子影响小、分析结果准确可靠等优点,并且可实现单分子分析、原位检测和实时检测。而聚合物纳米材料由于具有独特优良的化学物理性质是近年来开发出来的一种新型的纳米材料。因此荧光标记DNA与聚合物纳米材料的结合用于神经退行性疾病相关小分子、蛋白质、重金属离子等靶标的检测是分析化学研究的前沿工作之一,且对于医疗、农业、食品安全和环境科学等领域而言是一项重要的研究内容。本论文基于荧光标记DNA探针与聚合物纳米材料之间发生能量共振转移改变其荧光信号,再通过目标分子调控荧光信号的变化实现对抗氧化剂、铜离子、半胱氨酸和组氨酸的检测,结合微渗析取样技术实现对活体小鼠脑脊液中靶标的分析。因此,本研究论文发展了一系列靶标介导聚合物纳米材料与DNA探针之间相互作用实现调控荧光信号变化的分析新策略,以此开发了简单快速、灵敏度高、选择性好的传感分析新方法,应用于快速检测神经退行性疾病相关的小分子、重金属离子等靶标,为生化分析、医疗诊断等重要领域提供了新的设计思路和方法。本论文由四个部分组成,具体如下:第一章绪论首先,本章介绍几种常见的荧光标记DNA,聚合物纳米材料的种类及其当前的研究进展;并着重论述了神经退行性疾病相关靶标的作用机理、研究进展及分析方法,及阐述了本论文的研究意义和主要内容。第二章基于荧光素标记DNA与聚多巴胺相互作用的抗氧化剂分析方法设计及应用利用抗氧化剂抑制聚多巴胺(PDA)的形成来调控染料标记DNA和PDA的相互作用,本章提出了一种高灵敏度、高选择性检测脑脊液中抗氧化剂含量的方法。荧光素标记DNA(作为供体)与PDA(作为受体)通过“π-π”堆积作用发生共振能量转移(FRET)使体系荧光发生淬灭(“Off”状态)。然而,在抗氧化剂如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、抗坏血酸(AA)或高半胱氨酸(Hcys)存在的条件下,多巴胺(DA)自发氧化聚合形成PDA的反应被抑制,荧光素标记DNA无法与PDA发生相互作用而使体系的荧光保持不变(“On”状态)。结合微透析活体取样技术,本方法可以实现对正常/缺血/再灌注一系列处理的大鼠纹状体脑脊液中的抗氧化剂动态变化进行监测。第三章基于香豆素标记DNA结合Cu2+诱导的邻苯二胺氧化的Cu2+分析方法设计及应用本体系利用Cu2+诱导2,3-二氨基吩嗪(oxOPD)的形成,从而调控香豆素标记DNA(C-ssDNA)与二聚体oxOPD相互作用,设计了一种比率型荧光方法检测脑脊液中Cu2+含量。Cu2+诱导OPD氧化产生的oxOPD不仅会在576 nm显示出最大荧光值,而且还可以有效地与C-ssDNA结合,淬灭其在452 nm处荧光。该比率型荧光方法可以实现对Cu2+的高准确度、高灵敏度、高选择性检测,最低检测线达到4.32 nM。通过结合微透析活体取样技术,该方法能够实现对大鼠纹状体脑脊液中Cu2+的检测。该方法设计简单、操作方便、对于生物化学研究和大脑化学具有很大应用前景。第四章基于香豆素标记DNA结合Cu2+诱导的邻苯二胺氧化的组氨酸和半胱氨酸分析方法设计及应用基于半胱氨酸和组氨酸与Cu2+络合配位作用可以抑制ox OPD二聚体的产生,本章进一步发展了基于香豆素标记DNA结合Cu2+诱导的邻苯二胺氧化的组氨酸和半胱氨酸的比率荧光分析方法。该方法还可用于逻辑门的设计和实际样品中组氨酸和半胱氨酸的检测,在人体尿样分析中得到了较好结果,表明该方法在实际应用中具有广阔的应用前景。
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